蒲葵子乙醇提取物对人肝癌BeI-7402细胞增殖和迁移的影响

刘俊斌，吴卫红，靳君华

（1.内蒙古医科大学附属医院肝胆外科，内蒙古 呼和浩特 010050；2.内蒙古医科大学附属医院门诊办公室，内蒙古 呼和浩特 010050）

·论著·

蒲葵子乙醇提取物对人肝癌BeI-7402细胞增殖和迁移的影响

刘俊斌1，吴卫红2，靳君华1

（1.内蒙古医科大学附属医院肝胆外科，内蒙古 呼和浩特 010050；2.内蒙古医科大学附属医院门诊办公室，内蒙古 呼和浩特 010050）

目的研究蒲葵子乙醇提取物（EELC）对人肝癌Bel-7402细胞增殖和迁移的影响。方法将培养的Bel-7402细胞随机分为5组：对照组、150μg/ml EELC处理组、300μg/ml EELC处理组、10μmol/L Notch抑制剂DAPT处理组和10μg/ml抗血管内皮生长因子（VEGF）抗体处理组，分别处理后，采用MTT和划痕实验检测各组细胞增殖和迁移能力的变化，Western blot检测各组细胞内VEGF、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）及Notch胞内片段（NICD）等蛋白表达的变化，ELISA检测各组细胞分泌VEGF水平的变化。结果不同浓度EELC、DAPT和抗VEGF抗体处理Bel-7402细胞后，Notch-VEGF途径相关的VEGF、MMP-2、NICD等蛋白表达水平、VEGF分泌量、细胞的增殖和迁移能力均受到不同程度地抑制（P＜0.05）。而且EELC的抑制作用呈现一定的浓度依赖性和时间依赖性。结论蒲葵子乙醇提取物可通过Notch-VEGF途径抑制人肝癌Bel-7402细胞的增殖和迁移。

蒲葵子；人肝癌细胞系；Notch-VEGF；增殖；迁移

蒲葵子为棕榈科蒲葵的种子，味淡，性平，甘涩，微毒。南方民间有用蒲葵子治疗癌症的历史，现也已有不少关于蒲葵子抗癌活性和抗血管生成作用的相关研究报道[1-3]，尤其是蒲葵子的乙醇提取物具有较强的抗肿瘤作用[4]。肝癌是全球第三大致死癌症，具有恶性程度高，易转移复发等特点[5]。目前，在肝癌诊治方面已取得较大进展，但关于肝癌的转移机制仍需进一步阐明。

大量研究表明，肿瘤转移的发生、发展总是伴随着新生血管的形成，如果没有新血管的形成，肿瘤会处于生长抑制状态，甚至发生退化。如今，肿瘤转移中的血管生成已作为抗癌治疗的一个重要靶点，尤其在阻断Notch和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路方面[6]。Notch和VEGF通路的相互作用方式为相互调节，既有区别，又协同[7]。关于Notch和VEGF通路参与肝癌转移发生发展的研究已有相关报道，体内实验研究提示，蒲葵子可通过下调Notch通路来抑制肝癌转移的血管生成[4]，而关于蒲葵子针对肝癌细胞迁移机制的体外实验研究少有报道。因此，本实验拟以人肝癌细胞系Bel-7402为研究对象，在不同浓度蒲葵子乙醇提取物（ethanol extract of Livistona chinensis seeds，EELC）、DAPT或抗VEGF抗体处理下，分别采用MTT、Western blot、ELISA和划痕实验等方法，检测Notch和VEGF通路相关的分子表达，以此探究蒲葵子对Bel-7402细胞增殖和迁移能力的影响和分子机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

人肝癌细胞株Bel-7402购于美国ATCC细胞库，RPMI-1640培养基为美国GIBCO公司产品，蒲葵子购于西南偏冷草药房，人VEGF ELISA试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司，HRP-标记的山羊抗鼠二抗和HRP-标记的山羊抗兔二抗购于江苏碧云天生物技术研究所，鼠抗人NICD抗体、兔抗人VEGF抗体为美国Abcam公司产品，兔抗人MMP-2抗体和兔抗人β-actin为美国Santa Cruz公司产品，DAPT、MTT及DMSO为美国Sigma公司产品，胰酶为美国Invitrogen公司产品。其他试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1溶液配制将蒲葵子分别用10倍量95%乙醇回流提取3次，每次1 h，分别合并提取液，浓缩，冷冻干燥，备用。取一定量的EELC干粉，用DMSO和无水乙醇等体积溶解，配制600 g/L EELC储液，无菌过滤。用DMSO配制20 mmol/L DAPT储液。

1.2.2细胞培养和分组Bel-7402细胞用含10%灭活胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基，在37℃、5%二氧化碳（CO2）条件下进行培养。根据细胞生长情况，更换培养基，取对数生长期细胞用于实验。以下各实验的细胞均分为5组，对照组（细胞+培养基）、150μg/ml EELC处理组（细胞+培养基+EELC）、300μg/ml EELC处理组（细胞+培养基+EELC）、10μmol/L DAPT处理组（细胞+培养基+DAPT）和10μg/ml抗VEGF抗体处理组（细胞+培养基+抗VEGF抗体），各组细胞用相应处理的培养基孵育时间一致。

1.2.3MTT检测细胞增殖活性将Bel-7402细胞按1×104个/孔的密度接种于96孔板，每孔200μl培养基，24h后换液，并按24h和48h时间点培养细胞，各自分5组，分别加180μl相应处理的含血清培养基，每组设6个复孔。分别在24和48 h时间点，收集上清液，同时向待测孔加入20μl MTT溶液（5 g/L），37℃，4 h。弃上清液，每孔加入150μl DMSO，溶解后，酶标仪检测490 nm处各孔的吸光值（OD值），并按公式计算各组的细胞活性：细胞相对活性=处理组平均OD值/对照组平均OD值× 100%。

1.2.4Western blot检测Notch-VEGF途径相关蛋白表达将Bel-7402细胞按4×105个/孔的密度接种于6孔板，24 h后换液，进行无血清RPMI 1640培养24 h之后，向各组中分别加相应处理的无血清培养基。作用24 h后，提取细胞全蛋白，Western blot法检测VEGF、MMP-2、NICD等蛋白的表达。

1.2.5ELISA检测细胞VEGF分泌水平按1.2.3方法获取相应处理后的上清液，置于4℃冰箱保存，10 000 r/min，离心10 min，收集上清液，用BCA法检测蛋白的浓度。另取各组部分上清液，按ELISA试剂盒说明书操作，最后酶标仪检测，读取450 nm处的OD值，绘制标准曲线，计算各组细胞分泌上清液中每1 mg蛋白中的VEGF含量。

1.2.6划痕实验检测细胞迁移能力将Bel-7402细胞按4×105个/孔的密度接种于6孔板，待细胞长至80%左右汇合时换液，进行无血清RPMI 1640培养24 h。然后用200μl无菌枪头在单层细胞上划

痕，PBS洗去漂浮细胞，后向各组中分别加相应处理的无血清培养基培养。在划痕后0、24 h时间点，均通过倒置显微镜和电脑软件在同一位置观察划痕区域的细胞迁移情况，并计数。

1.3统计学方法

实验数据采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同处理对BeI-7402细胞增殖情况的影响

MTT结果显示，在24和48 h时间点，与对照组比较，EELC、DAPT和抗VEGF抗体组的细胞增殖均受到了不同程度的抑制（P＜0.05），而且随着作用时间的延长，抑制效果更加明显。同时，EELC对该细胞增殖的抑制作用随剂量的增加而增强，300μg/ml、48 h EELC处理对Bel-7402细胞有极其显著的增殖抑制作用，细胞相对活性低至31%。见图1。

图1 不同处理对BeI-7402细胞增殖的影响

2.2不同处理对BeI-7402细胞Notch-VEGF途径相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示，与对照组比较，EELC、DAPT和抗VEGF抗体组的细胞VEGF、MMP-2、 NICD等蛋白表达量均明显下调（P＜0.05），并且高浓度的EELC比低浓度的EELC对3种蛋白表达的下调作用更显著，有着明显的浓度-效应依赖关系。见图2。

图2 不同处理对BeI-7402细胞VEGF、MMP-2、NICD蛋白表达水平的影响

2.3不同处理对BeI-7402细胞分泌VEGF水平的影响

ELISA结果显示，见图3，在24和48 h时间点，EELC、DAPT和抗VEGF抗体等处理均能不同程度地降低Bel-7402细胞分泌VEGF水平，与同样时间条件下的对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。而且，EELC浓度越高，相应组细胞培养上清液中的VEGF含量越低。此外，随着作用时间的延长，各组

细胞的VEGF分泌量反而略有下降。

2.4不同处理对BeI-7402细胞迁移能力的影响

划痕24 h后，各组细胞均有不同数量的迁移，但对照组的细胞迁移现象最为明显，各处理组的细胞发生迁移的数目明显低于对照组（P＜0.05）。EELC、DAPT和抗VEGF抗体等处理对Bel-7402细胞的迁移能力都是有所抑制，并且该细胞的迁移能力与EELC浓度呈负相关。见图4。

图4 不同处理对BeI-7402细胞迁移能力的影响（×200）

3 讨论

肿瘤细胞的增殖和迁移是肝癌患者死亡的的首要原因，也是临床治疗易复发，预后差的主要原因[8]。在肝癌发生、发展过程中，肝癌细胞中的VEGF、MMP-2和NICD蛋白表达量相比于正常细胞均显著上调，与本实验结果一致。其中，VEGF是作用最强的血管生成因子，与肝癌细胞的迁移有关，可通过旁分泌途径诱导肿瘤血管生成，促进肿瘤生长；也可作为一种自分泌生长调节因子而直接刺激肿瘤生长。同时它还能诱导血管内皮细胞产生MMP-2等降解细胞基底膜和细胞外基质的蛋白水解酶，从而有利于肝癌细胞迁移进入脉管系统，促进血管内皮细胞增殖和血管形成。因此，VEGF几乎参与整个血管新生的病理生理过程。而NICD是Notch信号通路激活后，细胞表面的Notch受体与配体结合，在γ-分泌酶的水解作用下，Notch受体的胞内段被切割而形成的片段产物，随后该片段进入细胞核，作用于下游基因，从而产生各种生物学效应。总之，VEGF通路与肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移、血管形成以及复发密切相关；Notch通路则是结构高度保守的经典信号通路，参与生物个体发育和肿瘤不同发生发展的过程。

该实验发现，EELC作用能明显抑制Bel-7402

细胞的增殖和迁移水平，有一定的浓度依赖性和时间依赖性，说明蒲葵子在调控肝癌细胞的增殖和迁移能力有一定的抑制作用。抑制Notch或者VEGF通路也均使Bel-7402细胞的增殖作用和迁移水平明显降低，说明在抑制肝癌细胞增殖和迁移方面，蒲葵子、Notch抑制剂DAPT和抗VEGF抗体3者是有相同的抑制作用。另外，在EELC、DAPT和抗VEGF抗体分别作用下，Bel-7402细胞的VEGF分泌水平都明显降低，提示蒲葵子的抗肿瘤机制可能通过降低细胞分泌VEGF，而抑制内皮细胞VEGF受体表达，从而干预VEGF和Notch信号转导通路的实现。

本研究表明，蒲葵子可通过下调Notch通路来抑制肝癌转移的血管生成[4]；VEGF通路抑制剂能明显抑制VEGF引发的主动脉环微血管形成和植入的人工基底膜新血管形成[9]；在Notch信号上调的肿瘤发生中，抑制Notch通路可能加强VEGF抑制剂作用[10]；同时抑制Notch和VEGF通路并不影响肿瘤重量，但会导致血管退化，降低肿瘤活性，远高于单独抑制某一通路的效果[7]。可见Notch和VEGF通路在促进肝癌细胞迁移和肿瘤血管形成上是有共同之处的，并且蒲葵子很可能是通过Notch-VEGF途径来实现对肝癌细胞增殖和迁移的抑制。

本研究表明，抑制肝癌细胞Notch通路会导致VEGF表达下调[11]，VEGF的表达也可影响Notch通路[12]，可见Notch和VEGF信号通路是相互作用、相互调节的作用方式。而抗VEGF抗体可以中和VEGF的作用，抑制其与受体结合，从而抑制肿瘤细胞生长；Notch抑制剂DAPT则可下调Notch通路。本实验中，将不同浓度EELC、DAPT或者抗VEGF抗体分别与Bel-7402细胞共培养24 h后，检测到NICD、MMP-2和VEGF蛋白表达显著下调，即Notch和VEGF通路均明显受到抑制，进一步证实Notch和VEGF通路主要是通过相互作用来调节肝癌细胞的增殖和迁移能力，并且蒲葵子作用于Bel-7402细胞，可通过下调Notch和VEGF通路，进而抑制肝癌细胞的的增殖和迁移。

综上所述，Bel-7402细胞中的Notch-VEGF信号通路处于激活状态。其中VEGF、MMP-2和NICD等分子均为高表达，VEGF分泌量、细胞增殖和迁移能力也均处于较高水平。而蒲葵子可通过Notch-VEGF途径能明显抑制VEGF、MMP-2和NICD等相关分子表达，并使人肝癌细胞Bel-7402的增殖和迁移能力明显降低，且表现为一定的浓度依赖性和时间依赖性。因此，蒲葵子作用可显著降低肝癌细胞的增殖和迁移能力，抑制血管形成和肝癌转移，这无疑为今后蒲葵子应用于肝癌靶向药物的开发研究提供实验基础，也可能为肝癌治疗提供一条新途径。

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（刘东京 编辑）

Effects of Livistona chinensis seeds on proliferation and migration of hepatocellular carcinoma Bel-7402 cells

Jun－bin LIU1,Wei－hong WU2,Jun－hua JIN1
(1.Department of Hepatobiliary Surgery,2.Outpatient Office,the Affiliated Hospital,Inner Mongolia Medical University,Huhhot,Inner Mongolia 010050,P.R.China)

【Objective】To study the effect of ethanol extract of Livistona chinensis seeds(EELC)on the proliferation and migration of human hepatocellular carcinoma Bel－7402 cells.【Methods】Cultured Bel－7402 cells were randomized into five groups:control group,150 μg/ml EELC group,300 μg/ml EELC group,10 μmol/L DAPT group and 10 μg/ml anti－vascular endothelial growth factor(VEGF)group.After treatment,cell proliferation was determined by MTT assay and cell migration by wound－healing assay.Furthermore,the expressions of VEGF,matrix metalloproteinase－2(MMP－2)and Notch intracellular domain(NICD)in Bel－7402 cells were evaluated by Western blot,and the secretion of VEGF protein was detected by ELISA.【Results】Treatments with different concentrations of DAPT,anti－VEGF antibody and EELC inhibited the proliferation and migration of Bel－7402 cells,as well as the expressions of VEGF,MMP－2 and NICD proteins(P＜0.05). Additionally,EELC inhibited cell proliferation and migration as well as gene expressions in a dose－and time－dependent manner.【Conclusion】EELC may inhibit the proliferation and migration of human hepatocellular carcinoma Bel－7402 cells through Notch－VEGF pathway.

Livistona chinensis seed;Bel－7402 cell line;Notch－VEGF;proliferation;migration

R735.7

A

1005-8982（2015）24-0014-05

2015-04-14