依托咪酯对神经胶质瘤细胞缝隙连接通讯的影响

汪灵芝，黄焕森，廖敏，胡春旭

1.广州医科大学附属第二医院麻醉科，广东 广州510260；

2.广州中医药大学附属第二医院麻醉科，广东 广州510120

细胞缝隙连接(gap junction，GJ)是广泛存在于实质性脏器(如心脏、肝脏、肾脏、中枢神经、皮肤和肌肉等)组织细胞之间的一种蛋白质连接通道。GJ由不同的连接蛋白(connexin，Cx)组成，6个Cx环绕在一起组成一个“半通道”(hemichannel)，又称为连接子(connexon)。2个位于各自细胞胞膜上的“半通道”对接在一起形成一个GJ。有研究表明，GJ能增强化疗药物或者放射线对肿瘤细胞的细胞毒性作用［1-2］。本研究组其他成员的前期研究还发现，麻醉镇静药丙泊酚能够显著减低Cx32组成的GJ功能，减弱X射线对宫颈癌细胞的杀伤作用［3］。与丙泊酚相似，依托咪酯也是非巴比妥类静脉镇静药。但由于依托咪酯对血流动力学的影响小，循环稳定性优于丙泊酚，被广泛应用于临床麻醉和ICU镇静［4］。但依托咪酯对GJ通讯的影响目前仍未见报道。鉴于镇静药物主要的中枢神经系统作用，而Cx43是神经系统表达最丰富的Cx，本研究将在天然表达Cx43 的人胶质瘤细胞U87上观察常用镇静药依托咪酯对Cx43 组成的GJ 的影响。

1 材料和方法

1.1 实验细胞和试剂

本研究所使用的U87细胞购于美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)；本研究中的主要试剂：胎牛血清，青-链霉素，胰酶和DMEM 干粉等细胞培养试剂购于美国Gibco公司；依托咪酯(2 mg/mL)为江苏恩华药业股份有限公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 人胶质瘤细胞U87 的培养

将U87细胞培养于含10%胎牛血清和青霉素、链霉素的高糖DMEM 培养液中，置于37 ℃、CO2体积分数为5 %、饱和湿度的细胞培养箱中培养。细胞常规培养于培养瓶中，并通过0.25%胰蛋白酶消化法进行传代。实验前将细胞培养24～48 h，使其表达形成有效的GJ。

1.2.2 SRB法测定依托咪酯的细胞毒性

磺酰罗丹明B(sulforhodamine B，SRB)［5］是一种粉红色的氨基甲氧杂蒽类化合物，该染料在酸性环境下，能与三氯醋酸(trichloroacetic acid，TCA)固定后的细胞内大分子上的碱性氨基酸结合，结合染料的多少在一定范围内线性地反映了蛋白质的量，而蛋白质数量的多少与细胞的数目成正比。本实验依据参考文献［5］取不同浓度的依托咪酯作用U87细胞4 h，待药物处理后，每孔加入50 μL冰冷的50% TCA(终浓度为10%)于4 ℃固定。倒掉固定液，用超纯水冲洗、干燥后，每孔加入0.4% SRB，室温染色30 min，用1% 醋酸洗去游离染料，空气干燥后，每孔精确加入150 μL 10 mmol/L Tris溶解染料，用酶标仪在564 nm波长处测定吸光度(D)值，以只加培养液的空白对照组调零。

1.2.3 细胞接种荧光示踪法(parachute dye-coupling assay)［6］

检测U87细胞的GJ荧光传递功能：取对数生长期细胞，以1.0×105个/mL接种于6孔板。随机分为对照组、0.1 μmol/L依托咪酯组、0.5 μmol/L依托咪酯组和1 μmol/L依托咪酯组进行处理。将表达有Cx的细胞与荧光指示剂calcine-AM和DiI-CM共同温育， 使calcine-AM和DiI-CM进入细胞。 该细胞称为“供体细胞”(donor cell)。 将 “供体细胞”接种到接受过不同处理并已生长融合的U87细胞，即“接受细胞(receiver cells)”，培养4 h。待形成稳定的GJ后，用显微荧光系统观察，记录GJ功能。小分子的calcine(发绿色荧光)可以通过GJ进入相邻的“接受细胞”； 但大分子的DiI 不能自由通过GJ而留在”供体细胞”内， 使之易于识别。 计数一个“供体细胞”周围含有calcine的“接受细胞”作为GJ功能指标。

1.3 统计学处理

实验结果采用SPSS 13.0软件进行统计分析。两组之间计量资料比较进行t检验，多组之间计量资料比较进行ANOVA分析，组间比较采用LSD法，以P＜0.05为差异有统计学意义，统计图表采用Sigma Plot 10.0绘制。

2 结 果

2.1 依托咪酯对神经胶质瘤细胞的细胞毒性

为了排除依托咪酯本身的细胞毒性对GJ 数量的影响，我们首先用SRB法检测不同浓度依托咪酯对U87细胞生长的影响，选择对细胞生长无影响的依托咪酯浓度进行后续实验。结果显示，与空白对照组相比，0.1、0.25、0.5、1和5 μmol/L 依托咪酯在4 h内对U87细胞生长均无抑制作用(P＞0.05，表1)。

2.2 依托咪酯对Cx43组成的GJ功能的影响

细胞接种荧光实验结果显示，与对照组相比，U87细胞经0.1 μmol/L依托咪酯处理后，供体细胞周围接受细胞数量无明显变化，表明0.1 μmol/L依托咪酯对细胞间的GJ荧光传递功能无影响，而细胞经0.5和1 μmol/L依托咪酯处理后，供体细胞周围接受细胞数量明显减少，GJ荧光传递功能分别降低了(27%±5%)和(43%±4%)%(P＜0.05)；1 μmol/L依托咪酯的抑制率与阳性对照组对U87细胞上GJ的抑制作用相比较弱［17］。实验结果证明，依托咪酯可以显著降低由Cx43所组成的GJ功能(图1)。

表1 不同浓度依托咪酯对U87细胞生存率的影响Tab. 1 Effect of etomidate on viability of U87 cells

图1 不同浓度依托咪酯对U87细胞荧光传递功能的影响Fig. 1 The effect of etomidate treatment at different concentrations on the dye spread of U87 cells through gap junctions assessed by parachute assay

3 讨 论

在哺乳动物中，Cx蛋白几乎在所有类型组织中都有不同程度的表达。细胞间通过Cx构成的GJ进行信息和能量物质交换，在维持内环境稳定、调节细胞的增殖分化、机体的生长发育、伤口愈合等方面都发挥着重要的作用［6］。人体组织中已经发现有21种Cx蛋白，Cx蛋白依据其相对分子质量的大小命名，其中Cx43是分布最广泛的一种缝隙连接蛋白。

研究表明，中枢神经系统中由不同Cx所组成的GJ，允许神经元之间进行离子交换，是神经元之间的电突触结构，参与介导神经系统的信息传递及神经活动的同步化。中枢神经系统内数量最多的是星形胶质细胞，细胞之间亦具有广泛由Cx43组成的GJ。神经胶质细胞由Cx43组成的GJ在维持神经系统的外环境稳定及协调神经元的某些功能方面起非常重要的作用［7-8］。以往研究表明部分吸入麻醉药和静脉麻醉药能影响神经组织中的GJ功能，研究者发现七氟醚、安氟醚、异氟醚、氟烷以及丙泊酚等麻醉药可不同程度地阻断GJ［9-10］，并推测这可能与这些药物的麻醉作用机制有关。最近的研究还发现，GJ抑制剂能够增强全麻药物七氟烷和丙泊酚的中枢抑制作用［11］。本研究发现依托咪酯能显著抑制神经胶质瘤细胞Cx43组成的GJ，提示其对GJ功能的抑制可能参与其镇静催眠作用的产生。

近年大量研究显示，Cx43所组成的GJ能够增强化疗药物细胞毒性。GJ增强化疗药物细胞毒性的机制与“旁观者效应”(bystander effect，BE)有关。有学者认为，由化疗药物或者肿瘤自杀基因诱导产生的死亡信号可能通过相邻细胞间的GJ传递，导致单个细胞内死亡信号的放大［12］。Jensen等［13］报道由Cx43所组成的GJ能够显著增强顺铂对小鼠永生型成纤维干细胞的毒性，而细胞转染Cx43 RNAi后顺铂毒性明显下降；我们前期的研究也发现依托泊苷对睾丸癌细胞的毒性在有GJ存在的情况下显著增强，而应用GJ抑制剂能够显著减少由Cx43组成的GJ，从而降低依托泊苷的细胞毒性作用［14］。Cx43是神经胶质瘤细胞上的主要表达Cx。研究发现，针对神经胶质瘤细胞的HSV-TK/GCV的治疗在有GJ存在的情况下明显增强，而抑制Cx43组成的GJ功能能明显减弱HSV-TK/GCV对肿瘤细胞的作用［15-16］。最近的研究还发现，由Cx43组成的GJ参与介导miR-124-3p对U87和C6神经胶质瘤细胞的促凋亡作用［17］。由此我们推测，依托咪酯对GJ功能的抑制作用，可能会参与其调控神经胶质瘤细胞的化疗或者放疗敏感性。另外，GJ通道的开启及关闭受多种因素直接调控，如膜电位、pH 值、Ca2+、连接蛋白的磷酸化以及一些神经体液因子、蛋白质调节因子以及外源性化学物质等［18］。依托咪酯对GJ功能的影响是通过直接调控的方式或是间接通过影响Cx43的生存周期还有待我们下一步的深入研究。

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