巴戟天药材中耐斯糖含量近红外光谱测定方法的建立

周文婷，林 萍，王海霞，姬生国



巴戟天药材中耐斯糖含量近红外光谱测定方法的建立

周文婷，林 萍，王海霞，*姬生国

(广东药学院中药学院，广东，广州510006)

目的 建立巴戟天药材中耐斯糖含量的近红外光谱测定方法。方法 用高效液相色谱法测定114批巴戟天药材中耐斯糖含量，采集近红外光谱后，运用多元散射校正法，结合最小偏二乘法建立巴戟天耐斯糖含量的定量模型。结果 建立的耐斯糖近红外光谱定量模型，内部交叉验证决定系数为0.979 1，校正标准偏差为0.909 0，预测标准差为0.909 0，交叉验证的标准偏差为1.093 0。结论 该含量测定近红外光谱模型稳定、准确适用于巴戟天药材中耐斯糖的含量测定。

巴戟天；耐斯糖；近红外光谱；定量模型

巴戟天为常用的中药材，具有补肾助阳、强筋壮骨、祛风除湿等功效[1]。耐斯糖为2010版《中国药典》所规定的巴戟天指标性成分，其含量测定采用HPLC法。近红外光谱分析技术（NIRS）是在近几年发展迅速的一种中药质量分析技术，具有快速、方便、对样品无损的分析技术，光谱信息量丰富，图谱稳定性高等特点[2]，被广泛应用于中药材、中成药的定量、定性鉴别中。本课题组经过数年的研究，以道地的岭南中药材为研究对象，以陈皮的本草研究为基础[3]，成功将该技术应用于广陈皮、陈皮[4]以及其他药材，如广藿香[5-10]、高良姜[11-12]、枇杷叶[13-14]、广金钱草[15]、巴戟天[16]等中药材及部分中药制剂的质量评价中。本研究通过应用该技术对巴戟天中耐斯糖含量进行测定，以期为药材加工、生产等企业及同行分享巴戟天药材及制剂的质量控制方法。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验药材

本试验所需药材分别从广西省梧州市古龙镇、太平镇、岭景镇；广东省云浮市大方镇、千官镇；肇庆市高良镇等地的种植和栽培基地进行采集。采收期为2013年6~7月。经广东药学院中药学院姬生国教授鉴定为茜草科巴戟天属植物巴戟天How.的根。药材先置于烘箱中烘至七成干，取出，锤扁后烘至全干，粉碎过50目筛，备用。

1.1.2 仪器与试剂

傅立叶变换近红外光谱仪，配有样品旋转器和石英样品杯、漫反射积分球、OPUS光谱采集软件(Tensor37型，德国Bruker公司) 和TQ8.0分析软件。1120型全自动高效液相色谱仪（日本岛津公司），蒸发光散射检测器（Alltech ELSD3300），ODS-C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm，美国Agilent公司），BIY211b电子天平(日本岛津公司)，AY120型十万分之一分析天平(日本岛津公司) 。所用流动相为色谱纯，其余为分析纯。定量分析用耐斯糖对照品（批号：11891-201202），购于中国食品药品检定研究院。

1.2 方法

1.2.1 耐斯糖的含量测定

参照2010年版《中国药典》巴戟天项下之规定，采用HPLC对样品中耐斯糖的含量进行测定[17]，结果样品中耐斯糖的含量范围为3.344 0%~6.451 3%，符合《中国药典》所规定2%以上，均匀分布。

1.2.2 采集近红外光谱

样品粉末4 g，装入样品杯，振摇并使样品混合均匀。利用分辨率为8 cm-1的积分球漫反射系统进行检测，扫描34次; 扫描范围12000~4000 cm-1; 温度( 23 ± 0.5 ) ℃; 相对湿度35%~40%，每批样品重复装样并采集光谱5次，取平均光谱。114批样品近红外光谱重叠图如图1。

λ/cm-1

图1 114批巴戟天的近红外光谱重叠图

Fig.1 Near-infrared spectra of 114How. Samples

2 结果与讨论

2.1 定量分析模型的建立

根据样品中耐斯糖含量的分布，为保证样品集更具有代表性，要将样品分为验证集与校正集，其划分的比例为4:1，并且校正集含量范围要包含验证集样品含量[18]。采用TQ8.0数据分析软件预处理光谱，利用偏最小二乘法( partial least square，PLS)作为建模方法，对校正模型进行建立，内部验证采用交叉验证方法进行，用验证集样品检验校正模型的性能。校正集和验证集样品中耐斯糖含量情况如表1所示。

表1 校正集和验证集中耐斯糖的含量分布（%）

2.2 光谱预处理

作为一个全息光谱，很多干扰因素，如机器噪声、样品颗粒和光散射等的信息存在于近红外光谱中，对近红外吸收强度和样品中指标性成分数据的关系造成影响，使近红外模型准确性与稳定性产生偏差。因此，对原始光谱进行预处理是必须的。常用的预处理方法有多元散射校正法(multiplicative scatter correction，MSC)，标准归一化法(SNV)，一阶导数法(First derivative)，二阶导数法(Second derivative)[19]。

本实验采用PLS建立模型时，以内部交叉验证决定系数( R2) ，校正均方差( rootmean square error of calibration，RMSEC) 和预测均方差( root mean squared error of prediction，RMSEP)作为指标，用以对模型进行评价，R2越接近1，RMSEP和RMSEC 越小、表明校正模型建立越准确，RMSEP 越小，且RMSEP/RMSEC≤1.2时，表明模型能准确预测[20]。结果如表2所示。

表2 不同预处理方法对模型性能的影响

MSC可以消除基线偏移和平移现象，当采用该方法对光谱数据进行处理时，可得到的多元散射校正相关光谱具有高信噪比[21]。如表2所示，由于采用MSC+First Derivative方法时，R2最接近于1，因此开始时选择该方法，但是从RMSEP/RMSEC来看，两者比值大于1.2，故该方法并不能作为建模的预处理方法。而从MSC可看出，三个指标均符合要求，因此采用该方法对光谱进行预处理。

2.3 建模波段的选择

由图1可见，由于所有样品的近红外光谱近似，无法根据其判断耐斯糖含量与吸光度的关系，且如果建模波段过宽，则由于包含大量冗余信息而影响模型的准确性[22]。因此对建模区间的选择，对确定光谱与含量之间的关系是十分重要的。本实验将所获得的待测成分浓度与波长的吸光度进行线性回归，将系数与对应波长作图得到可相关光谱[23]，以R2、RMSEC、RMSEP 等为综合考察指标，选择合适的建模波段，通过对比，波段7502.80~4386.65 cm-1与耐斯糖含量具有较高相关性，因此选择该波段作为建模波段可以避免采用全谱建模所导致的不准确性，因此选择该波段为建模波段。结果见表3。

表3 不同建模区间对模型性能的影响

2.4 主因子数的选择

数据降维，是主成分分析法的中心法则，通过变换，使几个能够完全表达原变量数据特征的新变量作为原变量的线性组合。这几个新变量称为主成分或主因子[24]。采用PLS法建立定量校正模型时，要充分利用光谱的有效信息，同时要避免发生过拟合现象，因此需要选择合适的主因子数。本实验以校正集内部交叉验证均方差( Root-mean-square root of cross validation，RMSECV) 为衡量模型质量的因素，RMSECV数值越小，表示模型的预测精度高，RMSECV最小时，代表所选择的主因子数为最佳主因子数[25]。本实验RMSECV最小值为1.093 0，所对应的主因子数为8。结果见图2。

图2 RMSEC值随主成分的变化图

2.5 校正模型的建立

运用PLS法建立巴戟天耐斯糖含量的校正模型，图3为建立模型的校正集样品通过模型的交互验证后得到的预测值与实际测量值之间的相关图，从图中看出，在回归线的两侧，校正集样品能均匀地分布。RMSEC=0.909 0，R2= 0.979 1。图4为校正集与验证集样本的预测值与实测值之间的绝对偏差图，两个数值之间的绝对偏差在±2。

○校正样品； + 验证样品

图3 校正集样品交互验证得到的NIR预测值与参考值之间的相关图

Fig.3 Relationship between reference and predictive value in calibration samples

○校正样品； + 验证样品

图4 校正集样本与预测集样本的NIR预测值与参考值之间的绝对偏差图

Fig.4 Deviation between NIR value and HPLC value of calibration and validation samples

2.6 校正模型的评价

为了进一步评价校正模型，我们可以采用RPD，即相对分析误差，其计算方法为SD/RMSECV，若RPD ≥ 3, 说明模型效果良好, 所建立的定标模型可用于检测；如果2.5 ＜RPD ＜3, 说明可以利用所建立的模型进行定量分析, 但预测精度需要提高；如果RPD ＜2.5, 不能用近红外光谱技术对该成分进行定量分析[26]。

本实验所建立的定量模型RPD为3.430 9，说明所建的校正模型能应用于实际生产中。

棚栽果树需要良好的光照，但大棚内的光照强度一般只有自然条件下的60%～70%，同时，冬季自然光照时间短且强度较差，不能满足果树生长的需求。主要表现为果树枝条生长细长、叶薄色淡，花开后，坐果率低，果实品质差。因此，棚栽果树要想高产、高效，必须要解决棚内光照的问题。

2.7 校正模型的外部检验

我们需要利用验证集样品对模型进行外部检验来对校正模型的可靠性与稳定性进行分析，本研究利用所建立的校正模型对验证集样品进行预测，以预测值与参考值的比值为预测回收率，研究结果见表4。

表4 验证集样品的平均回收率

2.8 模型的重复性考察

取5份同一样品，分别采集其近红外光谱图，利用所建立好的定量分析模型对其含量进行预测，所得到的结果RSD为0.30%，表明经过模型得到的数值重复性良好，结果见表5。

表5 NIR分析模型重复性实验（%）

3 结论

本实验利用近红外光谱技术与化学计量法相结合，将巴戟天药材样品中的有效信息与对应样品中耐斯糖含量进行线性拟合，建立了耐斯糖定量分析模型，经过验证，巴戟天药材中耐斯糖的含量（%）按照HPLC测定的结果与近红外光谱模型测定的结果的绝对偏差在-0.136 5与0.151 3之间，25个检测样品的近红外光谱测定结果的平均回收率为100.05%，说明该模型准确、快速，适用于大批量药材的中耐斯糖含量的快速测定，我们获得了巴戟天药材的近红外光谱质量控制方法。

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QUANTITATIVE DETERMINATION MODEL OF NYSTOSE INBY NEAR INFRARED SPECTROSCOPY

ZHOU Wen-ting, LIN Ping, WANG Hai-xia,*JI Sheng-guo

(School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou, Guangdong 510006, China)

Objective: To establish the quantitative determination model of nystose inby Near Infrared Spectroscopy (NIRS). Methods: The nystose contents of 144 samples were Mmeasured by HPLC, and their spectrum were collected. Combined with MSC and PLS, the quantitative determination model were established. Results: The determination coefficient, root-mean-square error of cross-validation, root-mean-square error of calibration and root-mean square error of prediction were 0.9791, 0.9090, 0.9090 and 1.0930 respectively in the created calibration model. Conclusion: The quantitative determination model is steady, and can determine the content rapidly and accurately.

;nystose; NIRS; quantitative determination model

1674-8085(2015)05-0094-06

O657.33

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2015.05.018

2015-05-19；修改日期：2015-07-19

广东省科技计划项目（2009B030801044）

周文婷(1988-)，女，广东广州人，硕士生，主要从事中药资源开发与道地性研究(E-mail:wendychou840@163.com);

林 萍(1990-)，女，广东湛江人，硕士生，主要从事中药资源开发与道地性研究(E-mail: 305127358@qq.com);

王海霞(1989-)，女，海南儋州人，硕士生，主要从事中药资源开发与道地性研究(E-mail:361123010@qq.com);

*姬生国(1967-)，男，河南新乡人，教授，博士，硕士生导师，主要从事中药资源、中药质量标准及中药新药研究(E-mail:shengguo_ji@163.com).