茶多酚二甲基亚砜合剂对卷烟烟气遗传毒性的防护作用

黄波，龙颖，李东阳

南华大学公共卫生学院，湖南省衡阳南华大学 421001

吸烟与健康

茶多酚二甲基亚砜合剂对卷烟烟气遗传毒性的防护作用

黄波，龙颖，李东阳

南华大学公共卫生学院，湖南省衡阳南华大学 421001

目的 研究卷烟烟气所致人支气管上皮细胞DNA损伤以及茶多酚二甲基亚砜合剂的保护作用，为卷烟烟气对机体损伤的防护提供理论及实验依据。方法 将细胞分为5组：空白组、卷烟烟气组、茶多酚保护组、二甲基亚砜保护组、茶多酚二甲基亚砜合剂保护组；通过检测微核和多核细胞观察染色体损伤，彗星实验及H2AX蛋白磷酸化检测DNA的损伤，多核细胞法检测细胞HPRT突变。结果 BEAS-2B细胞经卷烟烟气染毒后，细胞的微核率、多核率、拖尾率升高，H2AX蛋白磷酸化表达增高，HPRT突变率增高，差异均有统计学意义（P＜0.05），茶多酚保护组、二甲基亚砜保护组能降低卷烟烟气诱发的DNA损伤，合剂保护组的防护作用最好。结论 卷烟烟气对BEAS-2B细胞DNA具有损伤作用，茶多酚二甲基亚砜合剂有较强防护作用。

卷烟烟气；茶多酚；二甲基亚砜；DNA损伤；防护作用

研究表明，肺癌的死亡率与烟草的消费呈显著正相关[1]。因此烟草被认为是人类致癌物质，自由基是卷烟烟气中主要的一类有害物质，能导致人体组织和细胞的氧化，损害细胞膜上的脂类和蛋白质，引发细胞病变、癌症等疾病[2-4]。我们在前期的研究中发现卷烟烟气抽提物（cigarette smoke condensates ，CSCs）染毒人支气管细胞(human bronchial epithelial cells line，BEAS-2B)后，导致细胞产生大量自由基，随CSCs染毒剂量而增高，细胞膜破裂，表现为细胞外的细胞内酶乳酸脱氢酶增高，细胞的DNA出现断裂，微核细胞增多，基因突变率增高，表明卷烟烟气通过诱发细胞自由基的大量产生，造成细胞的氧化损伤而引起遗传毒性。在采用卷烟烟气染毒时，加入茶多酚(tea polyphenols，TPs)，可使卷烟烟气诱发人支气管上皮细胞产生的自由基降低，细胞氧化损伤降低，能在一定程度减少从卷烟烟气的危害。前期的研究中同样发现，二甲基亚砜(DMSO)对卷烟烟气导致的人支气管上皮细胞遗传物质损伤、自由基增多、基因位点突变有较好的防护作用。发现DMSO对卷烟烟气作用于BEAS-2B细胞后，可引起彗星实验中彗星细胞增多，DNA损伤加重，具有一定程度的抑制作用，表明二甲基亚砜、茶多酚均能一定程度上降低卷烟烟气的氧化损伤[5-6]。

为更好地降低卷烟的危害，本实验通过采用茶多酚和二甲基亚砜的合剂，采用人支气管上皮细胞系（BEAS-2B细胞）作为靶细胞，验证对卷烟烟气抽提物所致遗传毒性的防护作用，为控制卷烟烟气危害及开发相关新药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人支气管上皮细胞（ BEAS-2B细胞）为军事医学科学院朱茂祥教授惠赠，以无血清培养基LHC-8培养，DMSO购自美国SIGMA公司，茶多酚（无锡太阳绿宝科技有限公司），卷烟烟气抽提物（CSCs）：将标准参照卷烟（2R4F，肯塔基大学，美国），通过JJD200型单通道吸烟机（郑州烟草研究院）导入气泡吸收管中的乙醇和细胞培养基（V/V= 1:1）收集抽提物，配制成1支烟/mL的卷烟烟气抽提物储备液，-80℃贮存备用[5]。

1.2 细胞分组及处理

处于对数生长期的人支气管上皮细胞分为5组：对照组(BEAS-2B)、卷烟烟气组(CSCs)、茶多酚保护组（CSCs+TPs）、二甲基亚砜保护组（CSCs+DMSO）、茶多酚二甲基亚砜合剂保护组（CSCs+TPs+DMSO）。卷烟烟气组细胞加入终浓度为0.01支/mL卷烟烟气抽提物；茶多酚保护组加入终浓度为 250 mg/L茶多酚、二甲基亚砜保护组加入终浓度为0.5% 二甲基亚砜，茶多酚二甲基亚砜合剂保护组加入0.5%二甲基亚砜+250mg/L 茶多酚，3个保护组加入上述保护剂后在细胞培养中孵育2h后，再加入终浓度为 0.01支/mL卷烟烟气抽提物，染毒24h。

1.3 微核多核细胞检测

细胞染毒24h后，弃去培养液，用冰冷的PBS洗净，消化细胞，离心，以固定液（甲醇:乙酸=3:1）重悬细胞固定 15 min，Giemsa染色后，在油镜下观察细胞，计数每1000个细胞中微核细胞数和多核细胞数。

1.4 中性单细胞凝胶电泳实验（彗星实验）

实验分组与染毒同上，染毒24h后，收集细胞制成悬液；收取细胞，并进行计数；将50-80μL 1%标准熔点琼脂糖滴在预热70-80℃毛玻璃载玻片上，以盖玻片压平胶液，放于4℃，冷却至胶液凝结；将计数后的细胞按照1:5的比例与低熔点的琼脂糖混匀，大约加入5000个细胞以盖玻片压平胶液，放于4℃，冷却至胶液凝结；以100μl低熔点的琼脂糖制作上层胶，冷却至胶液凝结；去除盖玻片，将胶块浸泡在4℃的中性细胞裂解液中，避光，90-120min，以Tris-硼酸（终浓度为0.5%，pH：8.2-8.5）浸泡胶块清洗残余的裂解液60min，重复3次；水平电泳槽中放入玻片，加入中性缓冲液盖过胶块3-5毫米左右，以25-30V于4℃冰箱中电泳30分钟，保持电流为5mA，取出玻片放于无Ca2+、Mg2+的PBS中洗1-2次，每片载玻片上加1.5μg/mL 的碘化丙锭，避光染色10min，400倍光镜下计数彗星细胞并拍照观察并拍照（奥林巴斯荧光显微镜显）；彗星细胞用casp.exe软件分析尾部DNA%、尾长。

1.5 磷酸化 H2AX蛋白表达检测（Western Blot）

5组细胞处理完毕后，收集细胞团块，加入蛋白裂解液，收集蛋白。用β-actin作为内参，具体步骤如下：

将提取的5组细胞蛋白按100μg总蛋白量上样，15%SDS-PAGE凝胶电泳，电泳到标记的溴酚兰至玻璃板的底部2h后停止电泳；以半干转膜仪80V恒压将蛋白转至硝酸纤维膜膜3h，TBST洗膜5分钟×3；以10%的TBST奶粉封闭液浸泡纤维膜，在生化培养箱中保温孵育1h，或4℃过夜；室温TBST洗膜5分钟；根据NC膜上的蛋白分子量标记将膜分为两半，一半检测β-actin蛋白，下一部分用于H2AX蛋白，将NC膜放入含β-actin抗体和H2AX抗体的缓冲液中（1:1000），生化培养箱中保温孵育1h，或4℃过夜；室温TBST洗膜3次，每次5分钟；根据β-actin抗体和H2AX抗体的属性，分别用对应的二抗TBST缓冲液（1: 1,000），生化培养箱中保温孵育1h，洗去二抗TBST缓冲液；避光显色检测两种细胞中β-actin蛋白和H2AX蛋白表达。

1.6 HPRT基因突变检测[7]

细胞分别处理后，弃去原有的培养液，换新鲜的培养液，传代5次后，分为两部分，一部分在培养液中加入终浓度为0.1mmol/L 6-巯基鸟嘌呤，另一部分常规培养，两部分细胞继续培养30 h后，均加入终浓度为6μg/mL的细胞松弛素B，37℃培养42 h；终止培养后，消化离心，制成单个细胞悬液，固定液（醋酸:甲醇 =1:3）室温15min；滴片干燥，吉姆萨染色15-20min，清洗，光学显微镜镜（1000倍）观察5000个细胞，记录在同一胞浆内具有完整核膜的双核或多核细胞（包括相压、相切和分离的双核或多核细胞数）。以6-TG培养的每1000个细胞中的多核或双核细胞数和常规培养的每1000个细胞中双核或多核细胞数之比，为HPRT基因位点发生突变的频率（‰）。

1.7 数据处理分析

用SPSS 13.0软件建立数据库，对实验数据进行统计学分析。数据采用χ－±s 表示。保护组与对照组、保护组与卷烟烟气组间的比较采用卡方检验进行分析。检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卷烟烟气致细胞微核多核发生的影响及茶多酚二甲基亚砜合剂的防护作用

0.01支/mL卷烟烟气能导致人支气管上皮细胞的多核细胞及微核细胞发生率增高（与对照组比较，P＜0.05），表明具有较明显的遗传毒性。3个保护组对诱发微核率及多核率增高有明显的抑制作用（与烟气组比较，P＜0.05），在3个保护组中，茶多酚二甲基亚砜合剂保护组的防护作用较二甲基亚砜、茶多酚单独使用更为显著（P＜0.05）。

表1 茶多酚二甲基亚砜合剂对卷烟烟气致微核多核细胞数增多的抑制作用(χ－±s，n=4)Tab. 1 Multinucleated cells and micronucleus induced by CSCs in BEAS-2B and protective effect of TPs DMSO mixture(χ－ ±s，n=4)

2.2 茶多酚二甲基亚砜合剂对卷烟烟气致细胞拖尾数增多的抑制作用

在单细胞凝胶电泳中，可见卷烟烟气染毒后可导致BEAS-2B细胞出现显著的DNA损伤，表现为彗星细胞数、彗星尾部DNA百分比增加，彗星尾长变长，与对照组相比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。3个保护组对卷烟烟气诱发的细胞DNA的损伤具有有明显的抑制作用，与卷烟烟气组相比较，差异有统计学意义（P＜0.05），在3个保护组中，茶多酚二甲基亚砜合剂保护组的防护作用较二甲基亚砜、茶多酚单独使用更为显著（P＜0.05）。

表2 茶多酚二甲基亚砜合剂对卷烟烟气致DNA损伤的抑制作用(χ－±s，n=4)Tab. 2 DNA damage induced by CSCs in BEAS-2B and protective effect of TPs DMSO mixture(χ－ ±s，n=4)

2.3 H2AX磷酸化检测

由图1可见，内参β－actin蛋白表达量各组基本均一，表示各组细胞上样量均一、准确。H2AX（Ser139）蛋白表达条带中，光密度值由高到低是卷烟烟气组、茶多酚组、二甲基亚砜组、茶多酚二甲基亚砜合剂保护组光密H2AX（Ser139）磷酸化程度表明卷烟烟气导致BEAS-2B细胞显著的DNA损伤；而3个保护组能具有抑制卷烟烟气DNA损伤的能力，其中茶多酚二甲基亚砜合剂保护组的保护作用最强。

2.4 HPRT基因突变检测

基因位点突变率检测发现，卷烟烟气可引起细胞HPRT基因突变率增高（P＜0.05）；3个保护组可抑制卷烟烟气引起的突变率增高，均具有统计学意义。

图1 茶多酚二甲基亚砜合剂对卷烟烟气致细胞Phospho-Histone H2AX表达增高的影响Fig. 1 Expression of Phospho-Histone H2AX induced by CSCs in BEAS-2B and the protective effect of TPs DMSO mixture

表3 茶多酚二甲基亚砜合剂对卷烟烟气致细胞HPRT基因突变率增高的抑制作用(χ－±s，n=4)Tab. 3 HPRT mutation frequency induced by CSCs in BEAS-2B and protective effect of TPs DMSO mixture(χ－ ±s，n=4)

3 讨论

卷烟烟气中有150多种化学成分有明确毒理学资料显示具有毒性，并被称为烟草烟气有害成分[8,9]。这部分化学成分具有较强的刺激性、致癌性和促癌性，可造成人体多器官多系统损伤，我们的研究也证明了这一点[5,6]。在我们的前期实验中，观察到卷烟烟气可以导致自由基的大量产生，导致细胞的抗氧化酶系出现失衡，细胞出现氧化损伤，诱发遗传毒性的产生，而茶多酚能够在一定程度上抑制卷烟烟气的危害[5]。

在本研究中发现，人支气管上皮细胞经卷烟烟气染毒后导致的细胞出现大量的微核多核细胞，彗星细胞增多，磷酸化H2AX蛋白高表达，HPRT突变率增高，表明卷烟烟气具有较强的遗传毒性，各保护组均能有效抑制卷烟烟气的DNA损伤，其中茶多酚与二甲基亚砜配合后的防护效果好于两者单独使用。说明茶多酚二甲基亚砜合剂对卷烟烟气引起的DNA和染色体损伤具有较强的保护作用。

基因突变可导致癌症的发生，所以检测敏感基因位点的突变率，是一种有效预测癌症发生的有效手段，HPRT基因就符合我们的需要，它的突变可受多种环境因素的影响，在多种人类肿瘤细胞中，可以发现HPRT突变频率比功能正常的肿瘤细胞高50-750倍[10]。

在多种检测DNA损伤的手段中，γ-H2AX的形成意味着DNA双链的断裂，是一个快速敏感的细胞反应，而且γ-H2AX表达高低是和外源性因素的剂量、强度、持续时间成正相关的，当DNA出现双链断裂时，可以通过γ-H2AX的表达量来检测DNA受损的严重程度[11,12]，是一个有效检测DNA损伤的生物标志物。

在本研究中发现，茶多酚与二甲基亚砜配合后的防护效果好于两者单独使用。由于生物机体内自由基的产生是一个多步骤，网络式的产生过程。单独使用一种自由基清除剂，仅能对其中一个步骤或节点产生作用，效率不高。如果能用多种性质不同、针对不同自由基产生节点的自由基清除剂组成复合自由基清除剂将会产生更好的效果，达到高效防护自由基的损伤作用。近年来，国内外专家分别提出了“抗氧化复合链”和“抗氧化网络”等概念，已逐渐成为抗氧化剂研究的一个热点[13]。多种性质自由基清除剂构成的抗氧化剂网络，由于彼此之间的协同作用，而使其自由基清除能力被放大，还可显著提高彼此的活性。在本研究中我们发现虽然茶多酚及二甲基亚砜单独使用对自由基的去除有一定的效果，但未达到理想的结果。所以，我们以上述理论为指导，采用性质不同的自由基防护剂茶多酚、二甲基亚砜联合作用，研究结果也发现达到了很好的防护效果，比单一使用效果更佳。这为卷烟的减害研究提供了新的思路。

[1]赵华谦, 李亚芳. 肺癌患者发病情况及影响因素的临床研究[J]. 河北医学, 2014,(01):148-150.

[2]Patel RR, Ryu JH, Vassallo R.Cigarette smoking and diffuse lung disease[J]. Drugs. 2008，68(11):1511-27.

[3]何智慧, 练文柳, 吴名剑, 等. 烟草中自由基的研究进展[J]. 化学分析计量, 2005,(01):60-62.

[4]Deslee G, Adair-Kirk TL, Betsuyaku T, et al. Cigarette smoke induces nucleic-acid oxidation in lung fi broblasts[J].Am J Respir Cell Mol Biol, 2010,43(5):576-84.

[5]黄波, 龙颖, 李东阳. 卷烟烟气抽提物对细胞遗传毒性及茶多酚干预作用[J]. 中国公共卫生, 2013,(06):823-825. [6]黄波，龙颖，黄锐，罗振华，贺性鹏.茶多酚对卷烟烟气致支气管上皮细胞损伤保护作用[J].中国公共卫生,2011,27（3）：284-286.

[7]吕兰海，杨陟华，尤汉虎．卷烟烟气及其主要有害成分诱发细胞基因突变的研究[J]．环境与健康杂志，2004，21 (5)：286-288.

[8]Rodgman A, Perfetti TA. The chemical components of tobacco and tobacco smoke[M]CRC Press INC，Boca Raton，2009.

[9]Fowles J, Dybing E. Application of toxicological risk assessment principles to the chemical constituents of cigarette smoke[J]. Tob Control,2003,12(4):424-430.

[10]JB Havla, CE Hill, SZ Abdel-Rahman, and E Richter,Evaluation of the mutagenic effects of myosmine in human lymphocytes using the HPRT gene mutation assay. [J]. Food Chem Toxicol, 2009，47(1): 237-41.

[11]Kuo LJ, Yang LX. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks[J]. In Vivo, 2008,22(3):305-9.

[12]Brett Ewald, Deepa Sampath, William Plunkett. H2AX phosphorylation marks gemcitabine-induced stalled replication forks and their collapse upon S-phase checkpoint abrogation[J]. Mol Cancer The, 2007, 12(6): 1239 - 1248.

[13]海春旭. 新的抗氧化研究理论简介[M]//第九次全国生物物理大会学术会议论文摘要集，2002: 101.

Protective effects of TPs DMSO mixture against genotoxicity of cigarette smoke

HUANG Bo, LONG Ying, LI Dongyang
School of Public Health, University of South China, Hengyang 421001, Hunan, China

Cigarette smoke condensates（CSC）induced DNA damage in BEAS-2B cells and protective effect of tea polyphenols DMSO mixture were studied with an objective to offer theoretical and experimental basis for protection against CSC-induced damage. BEAS-2B cells were divided into 5 groups, i.e. control, CSC, tea polyphenol protection, DMSO protection and TPs DMSO mixture protection.Chromosomal damage was determined by measuring the frequency of micronuclei and multinucleated cells. DNA damage was examined by comet assay and level of γH2AX. Gene mutation was detected by HPRT gene mutation assay. Results showed that after BEAS-2 B cells were exposed to CSC, frequency of micronuclei and multinucleated cells, tail length, expression of H2AX protein phosphorylation and mutation rate of HPRT were all increased signi fi cantly (P ＜ 0.05). Three protection groups effectively reduced these changes and tea polyphenol DMSO mixture protection group was proved the best group. It was concluded that CSC can cause DNA damage of BEAS-2 B cells and tea polyphenols DMSO mixture has a strong protective effect.

CSC; BEAS-2 B cells; tea polyphenols DMSO mixture; DNA damage; protective effect

:HUANG Bo, LONG Ying, LI Dongyang. Protective effects of TPs DMSO mixture against genotoxicity of cigarette smoke [J].Acta Tabacaria Sinica, 2015, 21(2)

黄波，龙颖，李东阳.茶多酚二甲基亚砜合剂对卷烟烟气遗传毒性的防护作用[J]. 中国烟草学报，2015,21（2）

国家自然科学基金资助(No. 81272994)

黄波（1974—），副教授，博士，研究方向为环境化学致癌及其医学防护，Email: huangbo0930@163.com

2014-04-16