不同养地方式对连作烤烟根际土壤微生物功能多样性的影响

尤垂淮，曾文龙，陈冬梅，黄锦文，唐莉娜

1 福建农林大学作物科学学院，福建福州 350002；2 龙岩市烟草公司，福建龙岩，364000；3 福建省烟草农业科学研究所，福建福州 350003

不同养地方式对连作烤烟根际土壤微生物功能多样性的影响

尤垂淮1，曾文龙2，陈冬梅1，黄锦文1，唐莉娜3

1 福建农林大学作物科学学院，福建福州 350002；2 龙岩市烟草公司，福建龙岩，364000；3 福建省烟草农业科学研究所，福建福州 350003

以烤烟-水稻复种连作8年的土壤为研究对象，通过田间定位试验，研究冬闲、稻草回田、冬种紫云英回田等三种养地方式对烤烟根际微生态的影响。结果表明，（1）土壤化感自毒潜力以冬闲养地方式烤烟根际土壤自毒作用最强，其次是冬种紫云英，稻草回田自毒作用最小。（2）基于 BIOLOG平板法的微生物功能多样性研究表明，冬闲利于以糖类、酚酸类物质为碳源的微生物生长；稻草回田利于以胺类为碳源的微生物生长；冬种紫云英回田利于以羧酸类、脂肪酸、氨基酸类为碳源的微生物生长。（3）土壤微生物利用碳源的多样性指数：SIMPSON(J)指数、SHANNON(H)指数、SHANNON(HE)均匀度指数、BRILLOUIN指数、McIntosh(Dmc)指数，均稻草回田处理高于冬闲和冬种紫云英，说明稻草回田最有利于改善烤烟根际土壤微生物多样性。可见，对改善土壤微生物群落多样性，减少连作土壤的自毒作用，稻草回田最好，其次是紫云英回田，冬闲最差。

烤烟；连作障碍；微生物；功能多样性；BIOLOG；土壤酶

烟草属茄科忌连作的作物，长期连作导致烤烟病害加重、产量与品质下降[1-3]。由于受到耕地面积的限制，福建烟区种植制度主要以烤烟-水稻复种连作为主，然而，随着复种连作年限的延长，连作障碍越来越严重，制约着烟叶生产的可持续发展，成为烤烟生产上亟待解决的问题之一。

连作障碍形成是根际土壤系统内诸多因素综合作用的外在表现，如土壤理化性状恶化、根系分泌物的自毒作用、病原微生物数量增加导致病虫害加剧等。已有研究表明，土壤微生物的数量与种类受耕作制度、作物种类及施肥技术等因素的影响[4-5]，适量绿肥、秸秆回田有利于提高土壤有机质，增加土壤微生物生物量，提高作物的产量和品质[6-7]。从土壤微生态角度，探讨不同养地方式对植烟土壤微生物种群和数量的影响，对福建烟区而言，在这方面的研究鲜有报道。福建烟区光热资源丰富，复种指数高，利用冬季农业养地是一个很好的选择。为此，本试验以烟-稻复种连作8年以上的土壤为对象，采用田间定位试验，通过在冬季设置不同的养地措施，包括冬闲、晚稻收获后采用稻草回田、冬种紫云英回田等措施，研究探讨不同养地措施对烤烟生长、土壤微生物功能多样性的影响，以期为建立合理耕作制度，减轻或解除烟-稻复种连作障碍提供理论依据，对指导烤烟生产具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2007-2013年在福建南平浦城仙阳烤烟试验站基地进行。供试烟田为烟-稻复种连作8年以上，供试烤烟品种为K326。试验田地势平坦，土壤质地为砂壤土，土壤pH值5.0，有机质34.8g/kg，速效氮180.0mg/kg，速效磷21.6mg/kg，速效钾103.0mg/kg，全氮2.38 g/kg，全磷0.73 g/kg，全钾34.5 g/kg，土壤阳离子交换量7.8 cmol/kg。

1.2 试验设计

试验设3种养地方式，即从2007年起，前处理均一致，上半年种烤烟，下半年种水稻，而后采用不同养地方式：A为对照（烤烟-水稻-冬闲），即早季种烟，烟收获后种水稻，水稻收获后冬闲；B：稻草回田，即早季种烟，烟收获后种水稻，水稻收获后稻草回田；C：冬种紫云英，紫云英回田。试验采用随机区组设计，每个处理设3次重复，共计9个小区。每个处理小区种5畦，每畦植烟44株，共220株，行株距1.2m×0.5m。田间管理按规范化栽培措施进行。田间定位从2007年开始，在田间定位的第4年（2010年），在烤烟生长旺长期，取烤烟根际土壤，进行土壤微生物和土壤酶活性分析；在烟株打顶后1周，观察记载烟株农艺性状；烤后烟根据烤烟国标进行分级测产，烟叶感官质量评价由郑州烟草研究院农业室进行评价。

1.3 试验方法

1.3.1 不同养地措施下烤烟根际土壤化感自毒潜力评价

烤烟根际土壤化感潜力评价主要采用土壤-琼脂三明治法[8]。配制0.8%的琼脂溶液，加热冷却至45℃时，取30 mL倒入培养皿（高度1.3 cm，直径6.2 cm），加入15 g新鲜烤烟根际土壤，用玻璃棒搅匀，置于室温，凝固后加入2 mL加热的0.5%琼脂溶液，冷却凝固后，播入10粒已萌发的烟草种子或者莴苣种子，均匀分布，以无土处理为对照，10次重复，在人工气候箱中培养。不同种植培养温度和时间不同，烟草种子培养温度为25℃，培养10天；莴苣种子培养温度为30℃，培养3天，每天光照12 h（7:00～19:00）。培养结束，主要测量植株根长。土壤化感潜力用相对抑制率（inhibition rate，IR），IR=(1-处理值/对照值)×100%。

1.3.2 烤烟根际土壤微生物功能多样性分析

根际微生物群落功能多样性主要采用BIOLOG ECO微平板(Biolog Inc., CA, USA)，每块生态板96孔，31种碳源和一个水作为空白对照，3次重复。具体操作程序主要是根据Choi等[9]的方法。生态板在28℃下联系培养7 d，每天固定时间用光吸收酶标仪在590 nm处读取每孔的吸光值，连续读取7 d。每块板上微生物活性采用平均颜色变化率AWCD(Average Well Color Development)表示，计算公式为：AWCD=[∑(C-R)]/N，其中C是所测定的31个碳源孔的吸光值，R为对照孔的吸光值，N为碳源的数目。土壤微生物群落功能多样性指数计算参照植物生态学中的方法[10]，计算采用反应96 h的测定结果。Simpsom 指 数 1/D =[∑ni(ni-1)/N(N-1)]-1；Shannon-Wiener指数H′=∑(pi×logpi)；Shannon均匀度E = H′/lnS；McIntosh指数U=(∑ni2)1/2；Brillouin 指数H =（1/N）/ln[N!(/n1!n2!n3!n4!......nn!)]；McIntosh均匀度指数E=(N-U)/(N-N(S)-1/2)。其中pi为第i孔相对吸光值（C-R）与整个平板相对吸光值总和的比率。S为颜色变化孔的数目，ni为第i孔相对吸光值（C-R）；N为吸光值总和。

1.3.3 土壤酶活性的测定

采用TTC（氯化三苯基四氮唑）比色法测定脱氢酶活性，过氧化物酶和多酚氧化酶采用紫色没食子酸比色法测定，脲酶用苯酚钠比色法，蔗糖酶用硝基水杨酸比色法，纤维素酶用蒽酮比色法，过氧化氢酶用高锰酸钾滴定法，蛋白酶采用Folin-Ciocslteu法测定，磷酸单脂酶采用对硝基苯磷酸二钠比色法[11]。

1.3.4 数据处理

采用SPSS11.5软件进行数据统计与分析。

2 结果与分析

2.1 不同养地方式对烤烟主要农艺性状的影响

研究结果表明（表1），不同处理之间烟株农艺性状呈显著差异。从烟株株高可以看出，B处理最高，其次是C处理，A处理相对较低，且三者之间达到显著性差异；有效叶数，处理B ＞ C ＞A。综合主要农艺性状来看，B、C处理优于A处理。

表1 不同养地方式对烤烟主要农艺性状的影响Tab. 1 Effect of different soil management methods on major agronomic traits

2.2 不同养地方式对烤烟产质量的影响

不同养地方式对烤烟经济性状的影响见表2。由2可以看出，不同养地方式对烤烟经济性状的影响呈显著差异，综合烤烟产量、产值、上中等烟比例表现，烤烟经济性状表现为B、C处理优于A处理。从中上部烟叶感官质量评价来看，稻草回田的B处理优于紫云英回田的C处理。

表2 不同养地方式对烤烟产质量影响Tab. 2 Effect of different soil management methods on the yield and output value of tobacco leaves

2.3 不同养地措施下烤烟根际土壤自毒潜力

研究结果表明（图1）：不同养地措施下，烤烟根际土壤对烤烟、莴苣幼苗根系的生长均具有明显的抑制作用，且差异达显著水平，即冬季采用休闲的A处理（烤烟-水稻-冬闲）烤烟根际土壤对烤烟、莴苣幼苗根长的抑制率分别为30.8%、49.4%，烟后作水稻间作紫云英回田的C处理烤烟根际土壤对烤烟、莴苣幼苗根长的抑制率分别为20%、31.3%；而烟后水稻收获后采用稻草回田的B处理（烤烟-水稻-稻草回田）烤烟根际土壤对烤烟、莴苣幼苗根长的抑制率分别为18.5%、25.6%。可见，不同养地措施下，采用稻草回田（B）的处理最有利于减轻烤烟土壤的自毒作用，而紫云英回田的次之，冬季休闲的最差，但稻草回田、紫云英回田处理间差异不显著。

图1 不同养地措施下烤烟根际土壤对烟草、莴苣根长的影响Fig. 1 Effect of different soil management methods on root length of tobacco and lettuce

2.4 不同养地措施下烤烟根际土壤微生物功能多样性分析

2.4.1 不同养地措施下烤烟根际土壤微生物碳源利用率分析

利用BIOLOG生态板测定不同养地措施下烤烟根际土壤微生物对羧酸衍生物、糖类、酚酸、脂肪酸、氨基酸类、胺类等6大类碳源的利用效率，结果表明（表3），不同养地方式下烤烟根际土壤微生物，除对糖类利用率未达显著差异外，对羧酸衍生物、酚酸、脂肪酸、氨基酸类、胺类等的利用效率，不同处理间均呈显著差异。以羧酸类、脂肪酸、氨基酸类物质为碳源时， 不同养地措施下连作烟草土壤微生物碳源利用的AWCD值均为紫云英回田处理＞稻草回田＞冬季休闲。以胺类物质为碳源时，不同养地措施下连作烟草土壤微生物碳源利用的AWCD值为稻草回田处理＞冬季休闲＞紫云英回田。以酚酸、糖类物质为碳源时，其影响规律则为冬季休闲处理＞紫云英回田＞稻草回田。进一步分析发现，冬闲最有利于以糖类、酚酸类物质为底物的微生物生长，稻草回田最有利于以胺类为底物的微生物生长；冬天种植紫云英回田最有利于以羧酸类、脂肪酸、氨基酸类物质的微生物生长。不同养地措施可显著影响烟草根际土壤微生物的功能多样性。

表3 不同养地方式烤烟根际土壤不同碳源培养条件下的微生物的AWCD值Tab. 3 Averages of well color development (AWCD) value for different types of carbon sources in rhizospheric soil under different soil management methods

2.4.2 不同养地措施下烤烟根际土壤微生物碳源利用特性的主成分分析

利用培养7d后的AWCD值，对不同养地措施下烤烟根际土壤微生物利用单一碳源特性进行主成分分析，结果表明（图2），与土壤微生物碳源利用功能多样性相关的主成分1、主成分2可分别解释变量方差的52.91%和47.09%。进一步分析发现，冬闲A处理烤烟根际土壤位于主成分1的正端，主成分2的负端；稻草回田B处理的烤烟根际土壤位于主成分1负端，主成分2的负端；紫云英回田C处理的烤烟根际土壤位于主成分1的正端，主成分2的正端。主成分得分系数与单一碳源AWCD值的相关性分析结果表明（表4），与两个主成分显著相关的碳源有17种，其中与主成分1显著相关的碳源有9种；与主成分2显著相关的碳源有8种。可见碳源在主成分分离中起主要贡献作用的是羧酸类、酚酸类、胺类碳源。

图2 培养7 d后土壤微生物碳源利用主成分分析的因子荷载图Fig. 2 Loadings for the principal component analysis (PCA) of microbe in monoculture soil of tobacco after cultured in media for 7 days

表4 土壤中与PC1和PC2显著相关的主要培养基成分Tab. 4 Main components in media that are signi fi cantly correlated with PC 1 and PC 2 in PCA for each soil

2.4.3 不同养地措施下烤烟根际土壤微生物利用碳源的多样性指数

土壤微生物群落利用碳源类型的多少可以用多样性指数表示[12]。研究结果（表5）表明，不同养地措施下烤烟根际土壤微生物群落功能多样性用不同指数表示时存在一定的差异。冬种植紫云英回田的养地方式的多样性指数均与冬闲、稻草回田养地方式有显著的差异，且均比它们低。稻草回田的SIMPSON(J)指 数、SHANNON(H)指 数、EVENNESS指 数、BRILLOUIN指数、McIntosh(Dmc)指数均比A、C高，说明稻草回田处理有利于修复烤烟根际土壤微生态，保持土壤微生物种群的多样性。

表5 不同养地措施下烤烟根际土壤微生物利用碳源的多样性指数Tab. 5 Diversity index for rhizospheric soil microbe in utilizing carbon source under different soil management methods

2.5 不同养地措施对烤烟根际土壤酶活性的影响

由表6可知，处理间除土壤脲酶未达显著差异外，土壤蛋白酶、纤维素酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、脱氢酶活性均呈显著差异。从整体上看，采用稻草回田处理和紫云英回田处理有利于提高烤烟根际土壤酶活性。

表6 不同养地措施下烤烟根际土壤酶活性Tab. 6 Rhizospheric soil enzyme activity under different soil management methods

3 讨论

烟草连作障碍是制约烟草产量与品质的关键因素。已有研究表明，不同程度的施肥用量或适宜的肥料种类可在一定程度上减轻烟草连作障碍[13-14]。本研究发现建立合理耕作制度，通过加强耕地的养地措施，培肥土壤，在一定程度上也可以减轻烟-稻复种的连作障碍。

土壤微生物在土壤微生态环境中对物质转化与分解具有特定的功能，土壤微生物群落数量及结构的变化直接影响着根际微生物整体功能[12]。通过培肥养地措施，可以改善土壤微生物种群和数量，进而改变连作土壤对烟草的化感自毒作用。运用土壤微生物的BIOLOG分析则从其利用单一碳源能力的角度阐明土壤微生物的功能。碳源平均颜色变化率(AWCD)及其功能多样性指数可以反映土壤微生物的活性及其功能多样性[15-16]。本研究运用BIOLOG技术分析不同养地方式对烟-稻复种连作的烟草土壤微生物功能多样性的影响，结果表明，单一碳源培养条件下，冬闲最有利于以糖类、酚酸类物质为底物的微生物生长；稻草回田最有利于以胺类为底物的微生物生长；冬天种植紫云英回田最有利于以羧酸类、脂肪酸、氨基酸类物质的微生物生长。由此说明，冬闲处理下以酚酸类为底物的微生物大量繁殖，紫云英的次之，而稻草回田最少，即可说明冬闲处理下根际土壤富含较多酚酸次生代谢物质，酚酸是主要的化感自毒物质，一定程度上抑制了烟草的生长，结合化感自毒潜力评价结果，冬闲处理下自毒潜力最强，而稻草回田最弱，由此可以看出稻草回田处理下酚酸较少积累，促进烟草的生长。

生态系统中物种多样性指数反映了种群结构的复杂程度。一般来说，多样性指数较高，系统的结构也较复杂，稳定性相对较高[12]。不同养地措施下烤烟根际土壤微生物群落功能多样性结果表明，稻草回田这种养地措施下烤烟根际土壤微生物的SIMPSON(J)指 数、SHANNON(H)指 数、EVENNESS指 数、BRILLOUIN指数、McIntosh(Dmc)指数均高于冬闲和冬季种植紫云英养地方式，即说明稻草回田这种养地方式下烤烟根际微生物多样性较好。由于土壤微生态系统微生物的种类繁多，这些微生物种类之间是如何传递信号促进或抑制其它类别微生物生长的，从而影响土壤化感自毒作用还有待于深入探讨。

4 结论

在烟-稻复种连作条件下，利用冬季培肥养地措施，可不同程度减轻连作对烟草生长带来的影响。冬季利用烟后稻的稻草回田最利于改善烤烟根际土壤微生物多样性，改善烟草连作障碍，提高烟叶品质，冬种紫云英回田次之，冬闲最差。稻草回田主要以促进土壤中利用胺类物质为碳源的微生物生长来调节或减轻连作对烟草生长的影响。

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Effect of different soil management methods on functional diversity of microbial fl ora in rhizospheric soil for continuous tobacco cropping

YOU Chuihuai1, ZENG Wenlong2, CHEN Dongmei1, HUANG Jinwen1, TANG Lina3
1 College of Crop Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China;2 Longyan Tobacco Company, Longyan 353000，Fujian, China;3 Fujian Research Institute of Tobacco Agriculture Sciences , Fuzhou 350003, China

Rhizospheric soil samples from tobacco-rice grow consecutively for 8 years were used to investigate the effect of different soil management methods on tobacco rhizosphere micro ecology. These methods include fallow, straw return to fi eld and winter vetch breeding.Results showed that monoculture soil treated with traditional fallow had the largest autotoxic allelopathic potential while soil treated with straw return to fi eld had the smallest. BIOLOG analysis showed that traditional fallow in winter was conducive to growth of microbial fl ora feeding on carbohydrate and phenolic acid as carbon sources. Rice straw return to fi eld was favorable to growth of microbial fl ora using amines as carbon source, and winter vetch breeding was good for growth of microbial fl ora feeding on carbohydrate, fatty acids,and phenolic acids as carbon sources. Diversity indices of microbes utilization of carbon sources suggested that microbial diversity, such as SIMPSON, SHANNON, EVENNESS, BRILLOUIN, McIntosh indices, in rhizospheric soil of fl ue-cured tobacco were robust under the treatment of rice straw return to fi eld. As for improving growth of microbial fl ora in continuous cropping soil, rice straw return to fi eld treatment was favorable to maintain rhizospheric soil nutrient equilibrium and to ameliorate the stability of soil micro-ecological system.Vetch breeding return to fi eld showed medium effect, and traditional fallow had the lowest effect.

tobacco; consecutive cropping problem；microbial fl ora; functional diversity; BIOLOG; soil enzyme

:YOU Chuihuai, ZENG Wenlong, CHEN Dongmei, et al. Effect of different soil management methods on the functional diversities of microbial fl ora in rhizospheric soil for continuous tobacco cropping [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2015, 21 (2)

尤垂淮，曾文龙，陈冬梅，等. 不同养地方式对连作烤烟根际土壤微生物功能多样性的影响[J]. 中国烟草学报，2015，21（2）

福建省烟草公司“福建烟区以烟为主耕作制度研究”项目(闽烟合同[2006]18号)

尤垂淮，博士研究生，从事烟草生理生态和优质烤烟栽培技术研究, Email: youchuihuai@126.com

唐莉娜(1966—)，博士，研究员，从事植烟土壤与营养施肥研究，Email：linatang@21cn.com

2014-08-04