昆虫病原线虫对黄地老虎致病力的研究

张安邦，南宫自艳，宋 萍，王勤英

(河北农业大学植物保护学院，河北保定 071000)

黄地老虎Agrotis segetum(Denis et Schiffermuller)属鳞翅目Lepidoptera 夜蛾科Noctuidae，广泛分布于全国各地，在我国每年发生2-4 代，食性很杂，是玉米、棉花、草坪和多种蔬菜的主要地下害虫。第一代幼虫于5月下旬至6月上旬进入为害盛期，是一年中为害最重的一代。黄地老虎幼虫共6 龄，3 龄之前一般在寄主植物新叶等幼嫩部位昼夜取食，危害不大，但是3 龄以后幼虫白天潜伏在被害作物或杂草根部附近的浅土层中，夜晚出来取食为害，将幼苗近地面的茎部咬断，使整株死亡，并可转株危害，每夜可咬断3-5 株，多达10 株幼苗，造成缺苗断垄(陈婧等，2013)。黄地老虎4 龄以上的幼虫不仅食量大，危害严重，而且因为生活在土壤中，只取食贴近土表的根茎部分，所以极难防治。

昆虫病原线虫(Entomopathogenic nematodes，EPN)以感染期虫态(infective juveniles，IJs)广泛存在于土壤中，具有寄主范围广泛、可主动搜寻害虫的特征，对一些化学农药难以防治的隐蔽性地下害虫和钻蛀类害虫尤为有效。昆虫病原线虫可规模化培养，生产成本低，对人畜、环境安全，自20 世纪以来，已成为发展起来的一种有潜能的生物防治因子，成功用于防治多种地下害虫(李晓巍等，1995;孙瑞红和李爱华，2004;许艳丽等，2008;雷利平等，2013)。国内外学者在利用昆虫病原线虫防治小地老虎、八字地老虎地老虎方面做了有益的研究和探索(赵奎军等，1995;杨建全等，2000;张思佳等，2005;Ebssa et al.，2012;Yan et al.，2014)，但是利用昆虫病原线虫防治黄地老虎幼虫的研究尚未见报道。为了探索昆虫病原线虫防治黄地老虎的可行性，本文测定了9个不同昆虫病原线虫中或品系对黄地老虎幼虫室内的侵染力，并测定了格氏线虫Steinernema glaseri ib(Sgib)对黄地老虎的田间防效。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试线虫

供 试 线 虫 Heterorhabditis indica LN2、H.bacteriophora HB8、H.sp HB-gy、Steinernema carpocapsae HB310、S.longicaudum CW105、H.bacteriophora H06、S.longicaudum CBZB、S.glaseri ib、S.feltiae sn 均来自河北农业大学害虫生物防治实验室。选取的昆虫病原线虫在生测前均用大蜡螟进行活体扩繁，在10℃保存，保存时间不超过15 d(Malan et al.，2011)。

1.1.2 供试昆虫

黄地老虎卵由中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室提供，在河北农业大学害虫生防实验室在温度为26℃±1℃，湿度(≥70%)的黑暗培养箱中饲养。黄地老虎成虫用10%的蜂蜜水饲喂;用棉铃虫的麦胚饲料(吴坤君，1985)将幼虫在20 cm×17 cm×7 cm 养虫盒内饲养至体长约3 龄后分装于3 cm×8 cm 的指形管中，每管一头(王伟等，2011)。

1.2 研究方法

1.2.1 不同昆虫病原线虫种类对黄地老虎致病力的测定

选取4 龄黄地老虎幼虫(体重0.5209±0.09378 g)为供试昆虫，测定9种侵染期昆虫病原线虫的侵染力。参照Malan(2011)等的方法，具体步骤如下:取直径90 mm 培养皿，其内垫一张同等大小滤纸，每皿加入1 mL 的1000 IJs/mL线虫悬浮液和4 头黄地老虎幼虫。每处理重复3 次，每重复20 头供试幼虫，以不含线虫的灭菌水作为对照，将各处理放入温度为25℃±1℃，相对湿度为80%左右的培养箱中。每隔24 h 检查并记录黄地老虎幼虫死亡情况，直至120 h。

1.2.2 不同线虫剂量对黄地老虎致病力的影响

以1.2.1 试验部分筛选出的高致病力昆虫病原线虫品系为研究对象，在垫有一层滤纸的24 孔板中每孔放入一头黄地老虎4 龄幼虫，每孔加线虫液40 μL，将筛选出的线虫品系分别以与黄地老虎幼虫数量比为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1、50∶1，实验条件、观察方法同1.2.1。

1.2.3 不同温度条件对线虫致病力的影响

以1.2.1 试验部分筛选出的高致病力昆虫病原线虫品系为研究对象，以黄地老虎4 龄幼虫为试虫，设计15℃、18℃、21℃、24℃、27℃和30℃共6个不同温度条件，测定不同温度对线虫致病力的影响，其他实验条件、观察方法同1.2.1。

1.2.4 不同土壤湿度对线虫致病力的影响

以1.2.1 试验部分筛选出的高致病力昆虫病原线虫品系为研究对象，黄地老虎4 龄幼虫为供试昆虫，试验设计5%、10%、15%和20%共4个不同含水量的细沙土。具体步骤如下:在直径3 cm×高5 cm 的塑料盒中放入3 cm 的一定湿度的灭菌细沙土，然后将1 头黄地老虎幼虫放入塑料盒中，并在其上部放入人工饲料。每盒滴入100 μL 的1000 IJs/mL 线虫悬浮液，同时设不加线虫100 μL灭菌水作对照，每处理20 头幼虫，重复3 次，120 h后检查并记录黄地老虎幼虫死亡情况。其他实验条件、观察方法同1.2.1。

1.2.5 线虫田间防治效果的测定方法

以1.2.1 试验部分筛选出的高致病力昆虫病原线虫品系为研究对象，以黄地老虎4 龄幼虫为供试昆虫，试验地选在河北农业大学试验园内，每个小区面积10 m×20 m，内种植有玉米，试验开始时间为2014年5月5日，玉米4 叶期，线虫处理小区和清水对照小区各3个，间隔排列。具体步骤如下:每个实验小区随机放置内10个直径11 cm、高8 cm的不锈钢纱网笼子，笼内装有土高约4 cm，将笼子埋入地下4 cm，使笼子内外土水平一致。每笼放入4 头黄地老虎幼虫。每处理重复3次，每重复40 头黄地老虎幼虫。在晚上7 点按667 m2施用1×109头线虫的剂量用喷雾器均匀喷施在试验小区，喷完后立即浇地。对照处理同上，喷施不加线虫的水。4 d 后取回并打开不锈钢纱网笼子，观察试虫死亡情况及死亡状态。

1.2.6 线虫田间持效期的测定方法

在1.2.5 田间试验后，每隔96 h 田间随机取土5 点，每样取土边长20 cm×高5 cm 的长方体，混合均匀。将土装入直径11 cm×高6 cm 的塑料盒内，土高4 cm，放入10 头5 龄大蜡螟，放于24℃培养箱中。每处理40 头大蜡螟，重复3 次，以对照田中的土为对照组，120 h 后检查并记录大蜡螟幼虫死亡情况。

1.3 数据分析

所有数据采用Duncan's 新复极差测验法(New multiple range test，SSR)(DPS v7.05 软件)单因素试验统计分析进行统计处理分析。

校正死亡率(%)=［(处理组死亡率-对照组死亡率)/(100-对照组死亡率］×100

2 结果与分析

2.1 不同昆虫病原线虫对黄地老虎幼虫的致病力比较

由表1 明显看出，9个不同昆虫病原线虫品系对黄地老虎幼虫的致病力差异非常大，即使是同一属不同种的线虫，甚至同一种线虫不同品系如HB8 和H06、CBZB 和CW105 对黄地老虎幼虫的致死率也存在较大差异(df=8，18，F=11.289，P＜0.05)。从侵染后几个时间段的试虫死亡率综合来看，在9种线虫品系中，格氏线虫Sgib 对黄地老虎幼虫致死效果最好，侵染后24 h、48 h 和72 h 的校正死亡率就分别达到了28.33%、89.28% 和98.15%，均显著高于其它线虫品系。说明黄地老虎幼虫对Sgib 最敏感，而S.feltiae sn和S.longicaudum CBZB 对黄地老虎幼虫的致病力最低，几乎不能侵染黄地老虎幼虫。

表1 9种昆虫病原线虫对黄地老虎幼虫的致病力Table 1 Pathogenicity of nine EPN species against Argotis segetum larvae

2.2 不同剂量的格氏线虫Sgib 对黄地老虎幼虫致病力的影响

对所筛选出的格氏线虫Sgib，进一步测定不同线虫剂量对该线虫致病力的影响。从表2 可以看出，黄地老虎幼虫的死亡率随线虫剂量的增加而上升。当线虫与寄主数量比达到并超过10∶1 时，在侵染后各时间段不同数量比之间均没有明显差异(df=4，10，F=19.528，P＜0.05))。

2.3 不同温度对格氏线虫Sgib 致病力的影响

由表3 可以看出，处理后24 h-72 h，21℃-30℃温度对Sgib 线虫的致病力没有明显的影响，但是在18℃和15℃条件下，Sgib 线虫的致病力显著降低了。处理96 h 和120 h 时，当温度为21℃-27℃时，Sgib 线虫对黄地老虎幼虫的致死率均在96%以上，不同温度间差异不显著，而当温度低于21℃或超过27℃时，随着温度的升高或下降线虫致病力不断降低，差异也越来越显著，在15℃时致死率仅为16.67%(df=5，12，F=11.289，P＜0.05)。由此可以看出，Sgib 对黄地老虎幼虫最适宜的侵染温度为21℃-27℃。

表2 不同数量格氏线虫Sgib 对黄地老虎幼虫的致病力Table 2 Pathogenicity of different dosages Sgib against Argotis segetum larvae

表3 不同温度条件下格氏线虫Sgib 的致病力Table 3 Pathogenicity of Sgib against Argotis segetum larvae at different temperature

2.4 不同土壤湿度对线虫致病力的影响

在温度为25±1℃的恒温培养箱内测定了不同土壤湿度条件下格氏线虫Sgib 对黄地老虎幼虫致病力的影响(图1)，可以看出，该线虫对黄地老虎幼虫的致死率随着湿度的增加而递增，湿度为15%时致死率为67%，土壤湿度为20%时，其致死率达到最大值100%。

2.5 格氏线虫Sgib 田间防治效果

为了检测格氏线虫Sgib 的田间防效，按1×109头线虫/667m2的剂量在田间喷施侵染期格氏线虫Sgib。由图2 可以看出，田间喷施格氏线虫Sgib后96 h 的供试黄地老虎幼虫死亡率为96.67%，喷施清水对照组的黄地老虎幼虫死亡率为1.67%，说明每667 m2使用1 亿头格氏线虫Sgib 剂量，就可以有效控制田间的黄地老虎幼虫。

2.6 线虫田间持效期的测定结果

对格氏线虫Sgib 侵染期线虫在土壤中的持效期检测结果表明(图3)，田间喷施线虫0 h 时格氏线虫Sgib 对大蜡螟幼虫的侵染率为100%，田间使用96 h 后对大蜡螟幼虫的校正死亡率下降为55.83%，192h 后为14.17%，288h 后为8.33%，下降速度很快。对照组死亡率稳定在5.83%-7.50%，不同时间无显著差异。

图1 不同土壤湿度对格氏线虫Sgib 致病力的影响Fig.1 Pathogenicity of Sgib to Argotis segetum larvae at different soil moisture

图2 格氏线虫Sgib 对黄地老虎幼虫的田间防效Fig.2 Control effect of Sgib to Argotis segetum larvae in filed

图3 格氏线虫Sgib 田间持效期Fig.3 Persistence period of Sgib in field

3 结论与讨论

昆虫病原线虫的寄主特异性较高，不同种、不同品系会对相同的宿主昆虫产生不同的防治效果，相同的种或品系对不同的寄主防效也不相同，选择适宜的线虫种或品系是获得成功防治的关键(Bedding and Miller，1981;Georgis and Gaugler，1991)。室内生物测定结果表明，本实验供试的9种昆虫病原线虫对黄地老虎幼虫的侵染力差别很大，其中格式线虫Sgib 的致病力最高，在每个时间段对黄地老虎幼虫的致死效果均高于其它线虫品系。

土壤中昆虫病原线虫的基数对于控制害虫的为害至关重要(刘树森等，2010)。格氏线虫Sgib不同数量对黄地老虎幼虫的致病力测定结果表明，在相同侵染时间内，线虫对寄主昆虫的致病力随线虫浓度的增高而增高，但当线虫数量与寄主数量比为10∶1 和50∶1 时，其侵染力结果无差异。根据24 孔板孔径面积和大田面积之比，当线虫与幼虫数量比为10∶1 时，田间需使用0.3×109/667 m2。考虑到田间土壤环境比较复杂，在田间施用时可以适当增加线虫量。

温度不仅影响昆虫病原线虫的存活、生长发育、繁殖、迁移活动、对寄主的侵染能力和致死速率(余向阳，2003;刘树森等，2010)，还影响其共生细菌的增殖(Dunphy and Webster，1986)。线虫温度的适合范围和它的采集地点有关，同一种线虫在高寒地区分离到的品系嗜低温，而在热带地区采集到的品系则适于较高温度下生长发育和侵染寄主(余向阳等，2003)。本文测定结果表明格氏线虫Sgib 品系侵染黄地老虎幼虫适宜温度在21℃-27℃，以24℃的致死率最高，温度降至18℃会使线虫的致死率明显下降，15℃基本休眠，Sgib 可以忍受30℃的高温，但感染力会下降，这与其他研究结果(Bakonyi and Nagy，2000)一致。

湿度影响线虫的存活和移动(余向阳等，2003)。昆虫病原线虫在土壤中移动需要土壤间隙有水膜(刘树森等，2010)，在湿度过低的情况下，线虫的存活率明显降低(余向阳等，2003)。孙瑞红等(2004)在针对H.indica LN2 线虫对韭菜迟眼蕈蚊幼虫侵染力的研究中也证实温度和土壤含水量显著影响线虫的致病力。线虫体表水膜张力对线虫的行为影响要远远大于重力(Crofton，1954)。实验表明，将线虫液滴在培养皿上，线虫活动能力随水分蒸发而减弱，线虫体表水分消失时，线虫立即死亡。本试验显示随着湿度的增加，格氏线虫Sgib 侵染活性呈上升趋势，不同湿度间差异显著，在湿度最大时达到100%。

田间实验按每667 m2施用1×109头格氏线虫Sgib，黄地老虎幼虫死亡率达到96.6%，而对照组死亡率为1.33%，表明昆虫病原线虫对黄地老虎幼虫有很好的致死效果。但随后测定的线虫田间持效期表明线虫在田间96 h 后对大蜡螟致死率下降一半，288 h 后几乎为检测不到Sgib 线虫的侵染。昆虫病原线虫在田间的生存受到温度、湿度、土壤等非生物因子和天敌等生物因子的制约(Chitwood，1937)，有研究表明将S.feltiae 线虫悬浮液施放在土壤后，2 周后就很难从土壤中回收。本实验持续期间，平均温度在13℃-27℃，天气晴，96 h 时田间5 cm 土壤的总含水量约13.21%，192 h 总含水量降低到5.89%，因此，土壤湿度可能是影响线虫在土壤中持效期的主要因素。黄地老虎幼虫3 龄之前全天都在寄主植物叶片上取食活动，在3 龄以后才入土隐蔽，并且晚上在表土层活动取食，因此，田间喷施线虫应在在黄地老虎3 龄以后，并且应选择在傍晚喷施才能取得好的防治效果。

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