DNA 条形码快速鉴定广州木槿蚜虫

汪珍春，邓其芬，陈诗颖，郑毅胜，姜立云

(1.广州大学生命科学学院，广州 510006;2.中国科学院动物进化与系统学重点实验室，北京 100101)

木槿 Hibiscus syriacus Linn.隶属锦葵科Malvaceae 木槿属Hibiscus Linn.的常绿灌木或小乔木，又称赤槿、佛桑、扶桑等，在中国岭南一带被俗称为大红花，是广州市的常见绿化植物。木槿在春、秋两季非常容易受到蚜虫的威胁，嫩枝、叶片、花蕾是其主要寄生部位，常造成叶面卷缩，花蕾不开放甚至脱落，蚜虫排泄的蜜露还会污染叶面和枝梢，造成烟霉病，影响木槿的生长和美观(Ellis et al.，1998)。

蚜虫类Aphidinea 昆虫隶属于昆虫纲Insecta 半翅目Hemiptera，世界已知5000 余种(Favret，2013)。中国蚜虫类资源丰富，已知种类有1100余种(Liu et al.，2009)。蚜虫体型很小，形态特征特化或退化，具有复杂的多型现象，有效的形态鉴别特征较少。通常每个蚜虫物种具有有翅孤雌型和无翅孤雌型2个型，在具有全周期生活史的蚜虫甚至多达5-8个型，包括干母、干雌、有翅孤雌型、无翅孤雌型、产雌性母、产雄性母、雌性蚜和雄性蚜(张广学和钟铁森，1983)。所采样本主要是无翅孤雌型和少量的有翅孤雌型。此外，许多蚜虫还有多种体色型，例如根据本研究发现棉蚜Aphis gossypii Glover 的体色有白色、白绿色、黄色、粉绿色、墨绿色和黑色等。

DNA 条形码(DNA barconding)是利用线粒体细胞色素C 氧化酶亚基I(Cytochrome coxidase subunit I，COI)作为动物通用的物种鉴定标记(Hebert et al.，2003)，通过对基因序列差异的分析可以将所有物种进行快速鉴定，不受物种形态鉴定知识缺乏的限制。DNA 条形码技术在许多动物类群中得到了应用，积累了大量的数据。在蚜虫物种鉴定方面也做了大量的尝试，结果表明COI基因可以很好地区分大部分物种，在蚜虫鉴定中具有显著的优势和应用价值(Wang and Qiao，2009;Pelletier et al.，2012;Rebijith et al.，2013;汪珍春等，2013;Armelle et al.，2014)。

城市绿化植物上蚜虫种类快速、准确的鉴定对于杀虫剂种类的选取，以及抗蚜虫品系的筛选都具有重要的指导作用，然而，仅依据形态特征开展的蚜虫物种鉴定工作中的错误鉴定和同物异名现象时有发生，而且需要具有扎实的专业知识与丰富经验的分类学者才能完成。因此，本研究采集了广州市越秀区、天河区、海珠区和大学城的木槿上的蚜虫样品共计64 份，通过扩增和分析其COI 基因，构建系统发育树，以期对广州市木槿蚜虫物种的快速、准确鉴定提供依据，为植保工作提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

研究用蚜虫样品均采自广州市木槿，共计64 份样品(表1)，涉及3 属5种。所采集的样品分别浸泡于75%和95%酒精中。其中，75%酒精浸泡标本用于形态鉴定，95%酒精浸泡标本用于分子实验。标本由中国科学院动物研究所乔格侠研究员鉴定，并保存于中国科学院动物研究所国家动物博物馆(中国，北京)和广州大学生命科学学院。

1.2 粗提DNA、PCR 扩增、测序以及序列比对分析

DNA 的粗提取:利用 TakaRa 公司的MightyAmp DNA Polymerase Ver.2 试剂盒对样品进行 DNA 粗提。该试剂盒由 MightyAmp DNA Polymerase(1.25U/μL)和MightyAmp Buffer Ver.2(Mg2+，dNTP plus)组成。本实验选取浸泡于95%酒精中的体型较大的单个蚜虫虫体，吸干虫体表面酒精后，用dH2O 漂洗3 次，浸泡过夜。次日更换dH2O 后，保留约3 μL 的dH2O，用研磨杵将虫体研碎，吸取上清液，即得到单个蚜虫DNA粗提液。

PCR 引物及扩增条件:扩增引物为通用引物LEP-F(ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG)和LEP-R(AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA)，用于扩增COI 基因3'端约700 bp 的片段。反应条件为98℃变性2 min，98℃变性10 s，54℃退火15 s，68℃延伸1 min，35个循环。68℃最终延伸10 min。扩增体系为20 μL，包括:MightyAmp Buffer Ver.2 10 μL，primer1 1 μL，primer2 1 μL，DNA 粗提液2 μL，MightyAmp DNA Polymerase 0.5 μL，dH2O 5.5 μL。

扩增产物测序:PCR 产物纯化后，利用ABI 3730xl 96-capillary DNA 分析仪(Applied Biosystems，USA，上海美吉生物医药科技有限公司广州分公司)进行双向测序。

序列比对、分析:通过 Seqman 5.01(DNASTAR，Inc.1996)软件对双向测序结果进行拼接、校对、切去引物得到 658 bp;应用DNAMAN 5.2.2(Lynnon Biosoft，Quebec，Canada)软件检验是否能正确翻译蛋白质以确保序列的正确性;在GENBANK 中进行BIAST 确定所获序列为蚜虫序列以排除其他物种的干扰;使用MEGA 5.0(Tamura et al.，2007)对序列进行多重比对。通过DAMBE 程序(Xia and Xie，2001)进行序列饱和性分析，以转换、颠换为纵轴，以TN93 模型(Tamura and Nei，1993)校正的距离为横轴做散点图。如果这些点随序列间距离的增大而呈线性分布，说明序列间的替换没有达到饱和，这些序列可以用于后续的分析;利用MEGA 5.0 查看核酸组成;基于K2P 模型(Kimura-2-parameter distance，Kimura，1980)，计算序列差异，构建邻接树(Neighbour-Joining tree，NJ tree)，并对各分支节点进行Bootsrap 检验(检测1000 次，每次检测随机加样重复100 次);应用EXCEL 软件(Microsoft Office Excel 2003)计算各差异频次，绘制频次图。

2 结果与分析

2.1 样品鉴定结果

所获64 份蚜虫样本经形态学和分子学鉴定，共涉及3 属5种，见表1。

表1 研究所用蚜虫样品信息Table 1 List of aphid samples used in this study

(续上表)

(续上表)

2.2 COI 序列特征分析

实验获得全部样品的64 条序列，经MEGA 比对后每个序列得到649 bp，编码216个氨基酸。碱基平均含量为40.9% T，14.0% C，34.8% A，10.3%G。A+T 含量为75.7%，C+G 含量为24.3%，存在明显的A、T 碱基偏好性。其中，有保守位点521个，可变位点128个，简约位点110个，单个突变位点18个。

2.3 COI 序列饱和性分析

运用DAMBE 软件对64个序列进行饱和性分析，结果显示(图1)，序列间转换、颠换数随距离增加呈线性增长趋势，未表现出饱和态势，因此所有数据都可被用于后续分析。

2.4 NJ 树结构分析

运用邻接法和K2P 模型构建了所有样本序列的NJ 树(图2)。结合系统发育树与形态鉴定的结果，共鉴定出木槿植物上蚜虫5种，分属2个亚科，即蚜亚科Aphidinae(3种)和长管蚜亚科Macrosiphinae(2种)。

从NJ 树可以看出，所有同一物种的样品都有效地聚为一支，支持率达99%。仅具有一个样品的物种也与其他物种明显地区分开。

2.5 遗传距离分析

图1 基于649 bp 线粒体基因COI 的序列饱和性分析散点图Fig.1 Saturation plots for the mitochondrial COI sequences with 649 bp

基于K2P 模型，计算了64 条COI 序列间的平均遗传距离为2.95%，标准差为5.45%，距离范围为0-10.90%。主要集中在0-1.20% 和6.60%-11.00%范围内，种内遗传距离和种间遗传距离之间形成明显的“Barcoding gap”(图3)。种内遗传距离为0-2.30%，平均距离为0.30%，标准差为1.17%。选取分别有3个以上样品的4个物种，计算了每个物种的平均种内遗传距离(表2)，桃蚜的种内遗传距离最小，为0;苹果蚜的种内遗传距离最大，为1.90%。种间遗传距离为3.30%-10.90%，平均遗传距离为9.00%，标准差为3.81%。5个物种间的平均遗传距离表明(表3)，苹果蚜和绣线菊蚜之间的遗传距离最小，为3.68%;苹果蚜和月季长管蚜之间的遗传距离最大，为10.15%。

图2 基于COI 序列和K2P 模型构建的NJ 树(自举检验支持率标注于分支基部)Fig.2 Neighbour-Joining(NJ)tree based on COI sequences and Kimura's two parameter(bootstrap percentages shown on the base of branches)

表2 各种种内遗传距离Table 2 Mean and range of intraspecific genetic distance

表3 各种种间遗传距离Table 3 Mean and range of interspecific genetic distance

3 结论与讨论

3.1 基于COI 基因的条形码对木槿蚜虫的鉴定效力

COI 基因作为条形码技术的分子标记，能否鉴定出物种取决于种间遗传距离和种内遗传距离的差异程度(Aliabadian et al.，2009)，在种间遗传距离与种内遗传距离存在“Barcoding Gap”时，鉴定成功率较高。Hebert 等(2003)对脊椎动物和无脊椎动物的线粒体COI 基因序列分析得出结论:除腔肠动物外，98%物种的种内遗传距离差异为0-2.00%，种间遗传距离差异平均可达11.30%。本研究收集了广州市越秀区、天河区、海珠区和大学城木槿植物上64个蚜虫样品，种内平均差异为0.30%，种间平均差异为9.00%，种间平均差异是种内平均差异的30 倍，物种间没有重叠(图3)。所有的样品鉴定效率达99%，说明所扩增的COI 基因作为鉴定木槿蚜虫的条形码是可行的。这一结论也与已有蚜虫条形码研究相一致(Pelletier et al.，2012;陈睿等，2013;Rebijith et al.，2013;王哲，2013;汪珍春等，2013;温娟等，2013;Armelle et al.，2014;)。

3.2 基于COI 基因的条形码有助于了解物种的多样性

图3 基于线粒体COI 649 bp 序列和K2P 距离的种间序列差异频次图Fig.3 Histogram of genetic divergence using mitochondrial COI 649 bp sequences.Divergences were calculated using Kimura's two parameter model(K2P)

从NJ 树上可以看出，木槿蚜虫在地理分布上存在一定的规律，所有区的木槿植物上都有棉蚜寄生，且聚为一支，没有出现种下分化，是为害木槿植物的主要种类。而桃蚜、苹果蚜、月季长管蚜主要分布在珠江以南的海珠区和大学城，尤以大学城的种类丰富，同时分布有4种。这主要与大学城的地理位置有关。广州大学城位于广州市番禺区小谷围岛，东经113°40'，北纬23°06'，面积17.9 km2，拥有南亚热带季风气侯，温暖多雨、光热充足、夏季长、霜期短等特征。大学城拥有绿化面积上千亩，植被500 余种，拥有完整而良好的生态环境，所以蚜虫的种类较丰富。而其他3个区为中心城区，植被多为人工栽培品种，较为单一，所以蚜虫种类也较单一，主要以棉蚜为主，且种群数量较大。木槿是棉蚜的主要冬寄主，夏寄主以黄瓜等蔬菜为主(Liu et al.，2000;Zhang et al.，2001)，当木槿秋季被棉蚜大范围为害后易造成夏季蔬菜的蚜虫虫害。因此，对COI基因序列的分析和研究可以为物种多样性研究提供信息。

3.3 基于COI 基因的条形码有助于蚜虫的鉴定

蚜虫具有非常复杂的多型现象，同时不同的生物型也存在不同的季节型或者颜色型。棉蚜在木槿的叶、茎、花上都有寄生，体色有白色、白绿色、黄色、粉绿色、墨绿色和黑色(图1)，仅根据形态学的鉴定很容易混淆，基于COI 基因的DNA 条形码能有效地将同一寄主同一器官或不同器官上颜色不同的蚜虫进行准确地鉴定。

因此，基于COI 基因的DNA 条形码可以帮助解决常见危害木槿上不同种蚜虫易被混淆的问题，同时还可以避免将特征差异较大(例如:体型不等、体色不同)的同种蚜虫鉴定为不同物种的错误，对非专业分类人员的快速准确鉴定蚜虫物种起到了极大的帮助，可为提高木槿蚜虫的防治效率，降低防治成本做出贡献。

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