熊果酸诱导HL—60细胞凋亡及抑制增殖与PTEN—Akt途径的相关性

[摘要] 目的 探讨熊果酸诱导人急性髓性白血病细胞系（HL-60）细胞凋亡及抑制增殖作用机制是否与PTEN-Akt信号传导途径相关。 方法 体外培养HL-60细胞。琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯形条带。Western Blot探讨UA对HL-60细胞PTEN、p-Akt蛋白表达的影响。 结果 UA可上调HL-60细胞PTEN蛋白表达和抑制P-Akt蛋白表达并呈时间依赖方式，PPARγ特异性阻断剂GW9662预孵育可拮抗此作用。 结论 熊果酸抑制HL-60细胞增殖及诱导凋亡与其上调PTEN蛋白表达，抑制抑制Akt磷酸化相关。

[关键词] 人急性髓性白血病；熊果酸；增殖；Akt

[中图分类号] R733.710；R735.205 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）17-31-04

Relationship between PTEN-Akt pathway and ursolic acid on apoptosis and in inhibiting the proliferation of HL-60 cells

YUE Jun

Shaoyang Center for Diseas Control and Prevention， Shaoyang 422000， China

[Abstract] Objective To investigat the relationship between PTEN-Akt pathway and ursolic acid in induction the apoptosis and in inhibiting the proliferation of HL-60 cells. Methods HL-60 cells line were cultured in vitro. To observe the DNA ladder bands by DNA agarosegel electrophoresis. To explore the influence of UA about the PTEN and p - Akt protein of HL-60 cells with western Blot. Results The expression of the PTEN protein to be increased and the expression of the P-Akt protein to be inhibited of the HL-60 cells by UA with time dependent manner. this effect to be blocked by GW9662 of PPARγ pre-incubated. Conclusion The proliferation to be inhibited and the apoptosis to be inducted by Ursolic acid with related by raising the PTEN and inhibiting the p-AKt protein.of the HL-60 cells.

[Key words] Human acute myeloid leukaemia； Ursolic acid； Proliferation； Akt

熊果酸（ursolic acid，UA）又名乌索酸，是许多中草药的主要有效成分[1-2]。熊果酸作为从天然植物中开发的抗炎和降血脂药物，目前在动物实验中得到很好的验证。最近，熊果酸的抗肿瘤活性越来越受到关注。有研究证实，熊果酸可诱导多种肿瘤细胞如乳腺癌[3]、卵巢癌肝癌[4]、BEL-7404[5]、肺癌、胃癌BGC823细胞[6]等发生凋亡。熊果酸还可以抑制人早幼粒白血病细胞增殖[7]，但其作用机制目前还不完全清楚。PTEN具有双特异性磷酸酶活性，是一种抑癌基因，目前发现大多实体瘤存在PTEN基因突变，血液系统肿瘤中有不同程度的缺失和低表达，但是突变罕见。PTEN作为PI3K/Akt途径的反向调控因子，通过抑制P I3K/Akt通路的激活抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡。本研究旨在探讨UA诱导HL-60细胞凋亡及抑制增殖作用与PTEN-Akt途径的相关性。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

HL-60细胞由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。用RPMI-1640培养基（10%小牛血清）在37℃，5%CO2的培养箱内培养，实验取采用对数生长期细胞。

1.2 药品与试剂

Sigmmma公司提供UA及GW9662；p-Akt、PTEN鼠抗人单抗和兔抗人多抗Sigmmma公司生产；PVDF膜购于Pall公司；DMSO购于Ameresco公司。

1.3 琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯形条带

按说明书步骤用凋亡细胞DNA ladder检测试剂盒分别提取未处理组、浓度为0.1，1.0，10.0μM的UA及DMSO 10μM处理细胞的DNA，提取10μL DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，观察并摄影DBT-08凝胶图像。

1.4 Western Blot分析HL-60细胞PTEN、p-Akt蛋白表达的影响

在培养板中接种1mL浓度为2×104/mL的

表3 GW9662对UA上调HL-60细胞PTEN蛋白表达的阻断作用（，n=3）

参数 浓度（μM）

空白对照 1.0 10.0 1.0+GW9662（10） 10.0+GW9662（10）

PTEN蛋白表达 100 189.000±1.970 219.500±3.666 140.333±2.219 98.900±1.114

t -78.259 -56.458 -31.484 1.711

P 0.000 0.000 0.000 0.162

注：各浓度与空白比较，P<0.05

HL-60细胞，并加入UA10.0μM孵育0，4，8，24h；收集细胞离心，进行蛋白定量测定；用胎牛血清标化对照组，加缓冲液煮沸5min后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF膜承载转移蛋白，用PTEN、p-Akt抗体孵育，加入过氧化物酶标记二抗使胶片感光。再用GW9662检测UA能否通过活化PPARγ影响PTEN、p-Akt蛋白表达。

1.5 统计学处理

各组数据利用SPSS17.0软件分析，计量资料用（）表示，采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DNA凝胶电泳观察UA诱导HL-60细胞凋亡作用

凝胶电泳探讨UA能否导致HL-60细胞的DNA发生非随机性剪切。结果证实出现典型“梯形”DNA条带；表明UA确实能够诱导人HL-60细胞凋亡。见图1。

2.2 Western blotting观察UA对对HL-60细胞PTEN- Akt信号途径影响

对HL-60细胞采用UA 1.0μM分别孵育0，4，8和24h后，结果表明UA能够上调HL-60细胞PTEN蛋白表达且呈时间依赖方式，较0h分别上调（176.33±7.83），（206.50±2.49）和（217.33±10.61），差异具有统计学意义（表1）；UA能够下调HL-60细胞p-Akt蛋白表达，同样呈时间依赖方式，较0h分别下调（82.800±4.69），（37.16±2.55）和（10.20±1.47），差异具有统计学意义（表2）。用特异性阻断剂GW9662 10.0μM预孵育30min后，采用UA（1.0μM，10.0μM）分别作用HL-60细胞24h，结果证实UA上调HL-60细胞PTEN蛋白表达作用能被GW9662有效拮抗，差异具有统计学意义（表3）。

3 讨论

肿瘤形成是多种因素、多个步骤和多种基因突变的过程，目前已经明确多类化学物质能够诱发和促进肿瘤形成，有许多研究证实熊果酸对肿瘤的形成有预防和抑制作用，且抗瘤谱广、不良反应低[8]；

M A B C D E

图1 DNA凝胶电泳观察UA对HL-60细胞凋亡的影响

表1 UA对HL-60细胞PTEN蛋白表达的影响（，n=3）

参数 时段

0h 4h 8h 24h

PTEN蛋白表达 100 176.33±7.831 206.500±2.498 217.333±10.617

t -16.883 -73.844 -19.141

P 0.003 0.000 0.003

注：各时段与0h比较，P<0.05

表2 UA对HL-60细胞p-Akt表达的影响（，n=3）

参数 时段

0h 4h 8h 24h

p-Akt表达 100 82.800±4.690 37.167±2.558 10.200±1.473

t 6.353 42.545 105.586

P 0.003 0.000 0.000

注：各时段与0h比较，P<0.05

许多人正致力于将其作为一种高效低毒的抗肿瘤药物用于临床的研究。实验证实，熊果酸能诱导肿瘤细胞凋亡，显著抑制某些恶性肿瘤细胞生长。熊果酸能够作用于HL-60 细胞周期，周期阻滞作用随着浓度升高明显加强；熊果酸能够诱导BEL-7404细胞凋亡，认为与上调caspase-9蛋白和抑制procaspase-3蛋白表达相关；熊果酸还可引起抗凋亡蛋白Mcl21的表达下调，在诱导HL-60细胞凋亡中起着重要的作用，分析认为熊果酸能降低Mcl21蛋白表达，从而促发Caspase23、Caspase29的降解/活化及PARP的降解，促发细胞凋亡过程。本人前期实验[9]证明熊果酸呈浓度依赖性下调Bcl-2蛋白、上调bax蛋白表达，抑制HL-60细胞增殖、诱发凋亡过程。

PTEN 主要通过抑制PI3K和PKB（又称Akt）磷酸化，进而影响细胞生长及凋亡过程。目前已经明确许多肿瘤发生与PI3K/Akt信号转导相关。胞质中PI3K 一般处在静息状态，相应受体与生长因子结合后，PI3K的p110催化亚基被激活。被激活的p110 催化亚基再磷酸化磷酸肌醇（PI）肌糖环的D3位点，使底物Ptd Ins（4，5）P2（PIP2）转化为Ptd Ins（3，4，5）P3（PIP3）。作为第二信使的PIP3激活下游的Akt 蛋白等[10]。AKT 激活是其发挥促细胞生存、增殖功能的重要前提，活化的Akt能降低凋亡促进因子活性和增加抗凋亡蛋白的活性，Bad蛋白被Akt磷酸化并释放被其抑制的抗凋亡蛋白Bcl-xL，磷酸化的Bad蛋白通过阻断细胞色素C的释放参与抗凋亡过程。如果抑制PI3K/Akt信号转导途径，导致明显下调细胞中Akt磷酸化水平，进而使细胞生长周期的激酶抑制因子P27/kIpI上调，干扰细胞生长信号，增加细胞对凋亡的敏感性。Woenckhaus等[11]的研究提示，在恶性肿瘤中阻断PI3K活性及其下游靶点Akt，上调催化亚基p110α的PI3KCA 基因， 从而增加卵巢癌细胞系PI3K 活性，促发卵巢癌细胞凋亡过程。英国学者对I型PI3K抑制剂PI103进行了研究，发现它能有效抑制PI3K的某些亚型，从而有效抑制卵巢癌细胞的侵袭能力[12]。日本学者也发现PI3K抑制剂LY29400能促进紫杉醇对卵巢癌细胞的凋亡作用[13]。

Akt通过磷酸化抑制caspase-9的活性抑制凋亡。Akt 抑制剂已经成为实验研究的热点，它能拮抗Akt的抗凋亡作用，使癌细胞耐药性被破坏，从而诱导癌细胞凋亡[14]。Yang等[15]的实验证实：化疗药物顺铂能诱导卵巢癌细胞凋亡，而Akt 激活可抑制该药物作用，抑制Akt 活性则该作用恢复，提示Akt可能与卵巢癌顺铂耐药有密切关系。

PI3K/Akt信号转导通路是PTEN的主要信号转导通路，PTEN是Akt通路的抑制因子，目前已经明确，PTEN 基因的缺失及Akt的磷酸化是血液系统恶性肿瘤发生的重要机制之一[16]。PPARγ是核受体转录因子，作为过氧化物酶体增殖体激活受体，能够使PTEN蛋白的表达上调；而GW9662能够抑制这种作用。

本实验用DNA凝胶电泳观察发现UA能够诱导HL-60细胞凋亡。Westernblot分析发现，熊果酸使HL-60细胞PTEN蛋白在各个时间段表达值不同，时间依赖性呈现逐渐上调趋势，P-Akt蛋白在各个时间段表达值也不同，时间依赖性呈现逐渐下调趋势。熊果酸的上调PTEN蛋白作用可被GW9662（10μM）预孵育拮抗，且以上实验结果差异均具有统计学意义。实验表明：熊果酸可通过作用HL-60细胞的PTEN-Akt途径，诱导HL-60细胞凋亡和抑制增殖。

综上所述，熊果酸诱导HL-60细胞凋亡和抑制增殖作用明显。它可能通过作用于HL-60细胞PPARγ、上调PTEN、抑制Akt磷酸化，抑制HL-60细胞增殖和诱导凋亡。

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（收稿日期：2015-04-28）