不同生长期槐角中4种黄酮苷元含量变化研究

李凤兰，杨佳年，何 珺*

(1.贵州省生化工程中心，贵州 贵阳 550025;2.贵州大学药学院，贵州 贵阳 550025)

槐角为豆科(Leguminosae)植物槐(Sophora japonica Linn.)开花生成的熟果实。槐角含有大量黄酮成分，主要有芸香苷、槲皮素苷、异鼠李素苷、染料木苷、山奈素苷等黄酮类物质。具有抗癌、抗氧化、保护中枢神经、保护心血管、抗菌降血糖等多种药理作用［1］-［7］。

槐树在全国各处均有分布，中药槐角产量十分丰富。国内目前上市制剂只有槐角丸和地榆槐角丸两种，因此其综合开发利用不高。已有文献报道HPLC法测定不同生长时间芦丁和槐角苷的含量［8］，元琦等建立了一种β-环糊精修饰区带毛细管电泳法内标定量分析槐角样品中染料木甙、染料木素、山奈素、槲皮素和芦丁5种黄酮类化合物的方法［9］，但用HPLC法同时测定不同生长期槐角中槲皮素、染料木素、山奈素、异鼠李素的含量国内(外)文献没有报道，因此，本实验采用酸水解法水解槐角中槲皮素醇苷、染料木素醇苷、山奈素醇苷、异鼠李素醇苷为苷元，并测定其含量生长变化规律，由此为根据可为槐角药材分离4种不同黄酮苷元物质确定最佳的采收期，为科学利用现有槐角资源提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

槐花及槐角，采自山西省运城市，经贵州大学药学院郁建平教授鉴定为豆科植物槐的花及果实，生长周期时间为2013年间6月15日至12月1日，采样自5棵槐树上有槐花苞开始，每15天采样1次，样品均80℃烘干，粉碎后过80目筛后备用。

1.2 仪器

分析型HPLC:Agilent Technology(1100series)，US，C18高效液相色谱柱(大连依利特分析仪器有限公司);电热恒温水浴锅:HH.SY21-Ni6(北京长源实验设备厂);超声波清洗器:SG2200HE(上海冠特超声仪器公司);电子天平:BSA124S(赛多利斯科学仪器有限公司);其他为一般常规仪器。

1.3 试剂

槲皮素(Sigma公司，批号 Q0125，纯度 ＞97%)，染料木素(上海同田生物技术有限公司，批号10080307，纯度＞97%)，山奈素(上海同田生物技术有限公司，纯度98%批号:10051321)，异鼠李素(上海同田生物技术有限公司，批号 10041206，纯度＞98%)，浓盐酸(分析纯，重庆川东化工有限公司化学试剂厂)，甲醇(分析纯，上海振兴化工一厂)，无水乙醇(分析纯，成都金山化学试剂有限公司)，冰醋酸(重庆川江化学试剂厂)。

1.4 测定方法

1.4.1 色谱条件与系统适应性试验 色谱条件［10］:Hypersil C18色谱柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm);流速:0.8 mL.min-1;检测器:紫外检测仪;波长:360 nm;柱温:35℃;进样体积:10 μL;流动相:甲醇-水-磷酸(470∶530∶0.3)。以峰面积为定量依据。在此色谱条件下，分别取对照品溶液和供试品溶液进样，确定四种黄酮苷元保留时间，对照品和供试品色谱图见图1。

图1 4种黄酮苷元混合对照品HPLC图谱Fig.1 The HPLC chromatograms offlavonoid aglycones

图2 12月槐角样品HPLC图谱Fig.2 The HPLC chromatograms of test sample

1.4.2 对照品溶液的制备 分别精密称取槲皮素、染料木素、山奈素、异鼠李素各5 mg于100 mL的棕色容量瓶中，加甲醇超声溶解配制为对照品母液。

1.4.3 供试品溶液的制备 精密称取槐角粉末50 mg置于10 mL试管中，加入水解液(甲醇-水-盐酸:5∶3.5∶1.5)10 mL，置68℃水浴加热3 h，取出冷却至室温，摇匀，用微孔滤膜滤过，取10 μL滤液上机测定。

1.4.4 标准曲线的制备 分别精密量取对照品的混合溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，在2.1条件下测定色谱峰面积，以峰面积积分均值对对照品溶液进样量(μg)进行线性回归(n=6)，结果见表1。可知该方法所测样品线性良好。

1.4.5 精密度试验 取对照品溶液重复进样5次，结果槲皮素、染料木素、山奈素和异鼠李素峰面积的 RSD分别为:1.03%、0.89%、0.62%、1.23%，表明进样精密度良好。

表1 4种组分工作曲线Tab.1 The working curve of four different compounds

1.4.6 重复性试验 分别精密称取同一样品5份，按2.3项下方法分别制成供试品溶液，HPLC法测定4种黄酮苷元的峰面积，计算平均质量分数分别为 0.62%、1.89%、3.10%、0.73%，RSD 分别为:0.37%、1.42%、0.74%、1.24%。表明该供试品溶液重复性良好。

1.4.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别于 0、4、8、12、24 h 测定，4 组分峰面积积分值的RSD分别为:1.31%、0.57%、1.21%、1.40%，结果表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

1.4.8 加样回收试验 精密称取已知含量批槐角10份，分别加入不同添加量的槲皮素、染料木素、山奈素、异鼠李素，按2.3方法制备后，各份均在2.1条件下进行测定，4种组分的平均回收率分别为 99.01%、98.24%、98.35%、97.79%，RSD 分别为 0.68% 、1.02% 、1.18% 、0.68% 。

2 结果与分析

2.1 不周生长周期槐角样品中4种黄酮苷元的变化

精密称取5个1.1项下不同槐树生长同期样品平行三份，按1.4.3项下方法进行处理，按1.4.1方法上机测定，取平均值，结果如下:

图3 不同生长期槐角中槲皮素含量(n=3)Fig.3 Thecontent of Quercetin in different growth periods

由图3可知，槐角中槲皮素在7月初含量最高，此时花蕾饱满，少数花蕾吐出花舌，槲皮素平均含量为12.4%，即为槐米采摘时节，然后随生长时间延长其含量逐渐减低，待槐角成熟后，其含量小于1.2%。

由图4可知，染料木素在八月中旬，即开花期产生，随生长时间的延长其含量逐渐增高，到10月中旬直至槐角采收的12月初含量趋向稳定，平均含量约为5.6%，就单颗槐角染料木素含量而言，12月采摘最合适。

图4 不同生长期槐角中染料木素含量(n=3)Fig.4 Thecontent of genistein in different growth periods

图5 不同生长期槐角中山奈素含量(n=3)Fig.5 The content of kaempferol in different growth periods

由图5可知，山奈素含量先升高，在八月中旬达到最大值，平均含量为6.2%，然后随生长时间延长逐渐减低，到10月中旬趋向稳定，平均含量约为3.0%。

图6 不同生长期槐角中异鼠李素含量(n=3)Fig.6 Thecontent of Isorhamnetin in different growth periods

由图6可知，异鼠李素含量在7月初含量最高，约为1.3%，然后随生长时间的延长其含量逐渐降低至0.24%左右。

图7 不同生长期槐角中总黄酮含量(n=3)Fig.7 Thecontent of flavonol in different growth periods

由图7可知，槐角中总黄酮含量在7月上旬和九月初含量最高，即开花期和槐角生长初期，含量大约为14%，然后随生长时间的延长总黄酮含量逐渐降低，槐角成熟期含量约为10%，因此就总黄酮而言，12月槐角成熟期采摘最好，因为此时果实重量最大，槐角产量最高。

3 讨论

3.1 槲皮素最佳采收期为7月初，此时花蕾饱满，少数吐出花舌，因为此时槐花中芦丁含量最高，经酸水解处理后，其苷元槲皮素含量最高。染料木素最佳采收期为12月初，此时槐角完全成熟染料木素单颗含量最高。山奈素最佳采收期为8月中旬，此时槐花凋谢槐角开始生长。而异鼠李素最佳采收期为7月初，在槐花开放时含量最高。因此可见槐角生长周期中4种黄酮苷元含量变化规律不同，可由此根据不同活性成分需求对槐角药材进行采收。

3.2 槐角中总黄酮苷元在开花期和槐角生长初期含量最高，大约为5.12% ～5.20%，开花期以芦丁即槲皮素苷为主要成分，槐角生长初期山奈素醇苷含量最高，但此时槐角果实不饱满，重量轻，黄酮总量小于成熟期槐角，综合考虑，如以总黄酮为指标采收槐角，则最佳采收期是12月初，此时槐角成熟，果实饱满，单棵槐角总黄酮量达到最大。

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