胃癌组织VIP与癌组织炎性细胞内NKG2D、PI3K p85α、NF-κB p65 表达的关系

万娟，孙姚，王翀，李媛媛，李国华

(1海洋石油总医院，天津300452;2新余市人民医院;3南昌大学第一附属医院)

近年多项研究表明，血管活性肠肽(VIP)在肿瘤免疫逃逸方面发挥一定作用［1～7］，但其作用机制研究尚少。NKG2D是NK基因复合体中的klrkl编码的Ⅱ型膜蛋白［8］，在 NK、γδ+T 细胞和 CD+8T 细胞介导的对肿瘤的免疫清除中起重要作用。结合NKG2D与VIP分别在胃癌免疫监视与逃逸中的作用，同时二者某些信号通路相同，但方式相反(兴奋或抑制)。因此，推测VIP对NKG2D信号通路有抑制作用，并可能在胃癌的免疫逃逸中起重要作用。本研究分析了胃癌组织中VIP与癌组织炎性细胞内NKG2D、磷酸肌醇3激酶(PI3K)p85α、核转录因子κB(NF-κB)p65的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2008年9月～2009年6月在南昌大学第一附属医院行胃癌手术者72例，术前均未接受手术或放化疗治疗，术中收集胃癌及癌旁正常胃黏膜组织。患者中，男52例，女20例;年龄40～60岁34例，≥60岁38例;病灶位于胃窦44例，胃体28例;有淋巴结转移44例，无淋巴结转移28例;癌组织高、中分化24例，低分化48例;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅵ期42例。

1.2 方法

1.2.1 胃癌及癌旁正常胃黏膜组织中 VIP、NKG2D、PI3K p85α、NF-κB p65 检测方法 所有标本固定后组织切片，采用免疫组化法(PV-9000及PV-6003二步法)进行染色。兔抗人VIP蛋白多克隆抗体工作浓度为1∶1 000，羊抗人NKG2D蛋白单克隆抗体工作浓度为1∶100，鼠抗人PI3K p85α蛋白单克隆抗体工作浓度为1∶200，鼠抗人 NF-κB p65蛋白多克隆抗体工作浓度为1∶50。所有步骤按产品说明进行，以PBS替代一抗作为阴性对照，用相应已知阳性切片作为阳性对照。免疫组织化学染色显示VIP主要位于癌细胞质内，NKG2D主要位于炎性细胞膜内，PI3K p85α主要位于炎性细胞质内，NF-κB p65主要位于炎性细胞核内。结果判断标准:①染色强度评分:棕褐色3分，棕黄色2分，浅黄色1分，着色很弱或未着色0分。②阳性细胞百分率计分:光镜下随机观察5个高倍视野(×400)，阳性细胞百分率0～5%为0分，5%～50%为1分，50%～75%为2分，＞75%为3分。二者相乘0分为阴性(-)，1～3分为弱阳性(+)，4～6分为中等强度阳性(++)，9分为强阳性(+++);+～+++均判为阳性。

1.2.2 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。阳性表达率比较采用χ2检验，等级资料比较用χ2或秩转换的非参数检验(Kruskal-Walls H检验)，相关关系采用Spearman等级相关分析法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 VIP、NKG2D、PI3K p85α、NF-κB p65 在胃癌及癌旁正常组织中的表达情况 见表1、2。

表1 胃癌及癌旁正常组织中VIP、NKG2D、PI3K p85α、NF-κB p65 阳性表达率比较(n=72，%)

表2 胃癌及癌旁正常组织中VIP、NKG2D、PI3K p85α、NF-κB p65阳性表达强度比较(n=72，例)

2.2 VIP、NKG2D、PI3K p85α、NF-κB p65 表达强度与胃癌临床病理参数的关系 见表3。

2.3 胃癌组织VIP与癌组织炎性细胞内NKG2D、PI3K、NF-κB表达的关系 胃癌组织VIP表达与癌组织炎性细胞内 NKG2D、PI3K p85α、NF-κB p65 表达均呈负相关 (r分别为 -0.341、-0.245、-0.249，P 均 ＜0.05)。

3 讨论

VIP属于胰泌素—胰高血糖素家族，是中枢和外周神经系统的重要递质;VIP受体广泛存在于不同动物种群的多种组织中，属于G蛋白偶联家族Ⅱ型受体;VIP与VPAC受体结合后，主要通过上调cAMP、腺苷酸环化酶和磷脂酶C，在多种固有免疫细胞中发挥作用［9～11］。

我们前期相关研究表明，胃癌中VIP mRNA表达增高，40%的胃癌组织含VIP阳性肿瘤细胞;VIP在体外对胃癌SGC7901细胞的生长有潜在的抑制作用，但这种抑制作用可以逐渐去敏感。本研究显示，胃癌较癌旁正常组织中VIP的表达强度明显增强，且与胃癌的组织分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关(P均 ＜0.05)。结合 VIP的“神经—内分泌—免疫”调节方式，说明VIP在胃癌的免疫逃逸中可能具有重要的作用［1～6］。

表3 VIP、NKG2D、PI3K p85α、NF-κB p65表达强度与胃癌临床病理参数的关系

NKG2D表达于多种免疫细胞并调节其功能，如NK细胞、T细胞、巨噬细胞、树突状细胞，参与适应性及固有性免疫应答。NKG2D介导的免疫监视在限制肿瘤的发生、发展中起重要作用［12～14］。本研究显示，在胃癌组织炎性细胞内NKG2D阳性表达率及表达强度均低于癌旁正常组织，且与胃癌的组织分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关(P均 ＜0.05)。说明胃癌组织中免疫细胞表面NKG2D表达下调，可能使机体免疫监视作用减弱，从而助长了胃癌的发生、发展。那么，NKG2D表达下调的原因何在。本研究显示，胃癌组织中VIP表达与胃癌组织中炎性细胞内NKG2D表达呈负相关。提示胃癌组织中VIP可能通过抑制癌组织中炎性细胞NKG2D的表达，降低机体或局部的免疫监视作用，促使癌细胞逃避免疫细胞的杀伤，从而参与胃癌的免疫逃逸。

NKG2D活化信号的传导主要通过接头蛋白DAP10、DAP12与受体结合。接头蛋白DAP10含有与CD28胞质段类似的YXXM序列，可与PI3K结合活化下游分子［15］。由于PI3K在炎性细胞中的广泛作用，PI3K表达下调或活性下降可削弱炎性反应和免疫反应［1］。PI3K及其下游蛋白Akt构成的PI3K/Akt信号传递途径是细胞信号转导的经典途径之一，并与多种免疫细胞的增殖、分化、活化、对靶细胞的杀伤及人类肿瘤的发生、发展密切联系［16～19］。NF-κB是PI3K/Akt信号途径下游调节细胞凋亡的关键因子，广泛存在于多种细胞中，包括淋巴细胞及非淋巴细胞，在炎症反应、免疫及细胞增殖、凋亡等多过程的基因调控中发挥着重要作用。其通过对细胞因子及免疫受体等编码基因的转录调控来实现对机体的免疫调控，特别是在创伤、感染及机体免疫功能紊乱的情况下发挥作用。

PI3K/NF-κB及其介导的细胞信号转导通路在多种细胞功能中发挥着重要作用，使其成为研究热点［20］，而且主要研究集中在肿瘤细胞中PI3K/NF-κB调控信号的改变，特别是其抗细胞凋亡及对细胞周期的调控作用，与肿瘤的发生、发展关系密切，但PI3K/NF-κB在肿瘤细胞免疫逃逸过程中的作用研究尚少。本研究结果显示，PI3K p85α、NF-κB p65在胃癌组织炎性细胞内的阳性表达率及表达强度均显著低于癌旁正常组织，与胃癌的组织分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关(P均＜0.05)，且VIP与PI3K p85α、NF-κB p65表达强度呈负相关。而我们的前期研究提示，癌细胞中 PI3K p85α、NF-κB p65表达明显上调，在炎性细胞中表达下降的原因何在呢?可能有以下几点原因:①VIP受体在癌细胞中表达明显下调，使VIP对PI3K、NF-κB的抑制作用明弱;②胃癌组织内可能存在其他细胞因子和(或)相关因素对VIP的作用产生抵抗;③胃癌患者体内非经典的MHC-Ⅰ类分子(如MHC-E、MHC-G)表达增多和(或)其他细胞因子的作用，抑制了NK等细胞相关活化性信号NKG2D/DAP10/PI3K/NF-κB的作用［21］。④受癌组织中其他癌基因或抑癌基因产物的影响。

综上所述，胃癌组织中的炎性细胞主要是参与免疫功能的免疫细胞，因此胃癌组织中的VIP可能通过抑制癌组织炎性细胞内NKG2D/PI3K/NF-κB信号转导通路，进而抑制机体局部免疫细胞的监视作用，达到胃癌免疫逃逸的目的。但是，VIP抑制NKG2D后是抑制其下游分子的作用，还是对通路中其他分子也有直接作用，有待进一步研究。

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