缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织MMP-9、TIMP-1表达变化及意义

梅梅，李慧玲，李春玉，聂磊

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154002)

缺氧缺血性脑损伤(HIBD)以脑组织水肿、软化、坏死和出血为主要病变，其中脑水肿包括早期细胞毒性水肿和血脑屏障(BBB)损伤引起的血管源性脑水肿(VBE)［1～3］。基质金属蛋白酶(MMPs)是一组 Zn2+依赖的金属蛋白内切酶家族［4］，其中MMP-9的活性受其金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)的特异性抑制，二者在成年缺血再灌注脑损伤大鼠VBE的形成中发挥重要作用［5～7］，但二者是否也参与了HIBD新生大鼠VBE的形成，目前国内报道较少。2013年5月～2014年12月，我们建立了新生大鼠HIBD模型，观察其脑组织MMP-9、TIMP-1表达变化，并探讨其与HIBD过程中VBE发病的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 健康7日龄新生Wistar大鼠72只，雌雄各半，体质量雌性230～250 g、雄性310～340 g，购于佳木斯大学实验动物中心。MMP-9、TIMP-1兔多克隆纯化亲和抗体均购于北京博奥森生物技术有限公司，免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物制品有限公司。TK-C721EC彩色摄像机购于北京杰伟世视频设备有限公司，BI-2000病理图像分析系统购于成都泰盟科技有限公司。

1.2 分组与造模 将72只大鼠随机分为观察组和对照组各36只。观察组吸入乙醚麻醉，仰卧位胶布固定于手术板上，常规乙醇消毒颈部皮肤;颈正中1 cm左右纵形切口，钝性分离皮下组织和肌肉。游离并暴露左侧颈总动脉，以5-0号丝线双线结扎后剪断，缝合皮肤，碘伏局部消毒。新生鼠返回母鼠身边恢复2 h后，置于自制37℃恒温水浴缺氧舱内;以1～2 L/min持续输入含8%氧气、92%氮气的混合气体，保持氧浓度为8.0% ±0.5%;2 h后将鼠取出，返回母鼠身边继续喂哺。对照组手术分离左侧颈总动脉后不结扎，缝合手术切口后返回母鼠身边喂哺，不予低氧处理。

1.3 标本处理 两组分别于造模后6 h(T0)、12 h(T1)、24 h(T2)、72 h(T3)、5 d(T4)、7 d(T5)各处死6只，断头取脑;以视交叉为切点，冠状位向后取一片厚约3 mm的组织;经常规甲醛固定、PBS冲洗、梯度乙醇脱水及二甲苯透明后，石蜡包埋切片。剩余脑组织保存待用。

1.4 脑组织病理观察 取两组造模后72 h的脑组织切片，常规HE染色，光镜下观察病理情况。

1.5 脑组织MMP-9、TIMP-1检测 采用免疫组化SP法。标本切片常规脱蜡至水，经过氧化氢室温孵育、蒸馏水冲洗后浸入枸橼酸盐缓冲液中，分别滴加稀释的一抗、二抗，PBS洗涤，DAB显色。以PBS代替一抗作为对照，MMP-9、TIMP-1阳性为细胞质染成浅黄色、棕黄色或棕褐色。每张切片400倍下随机选取不重复的6个视野，计算MMP-9、TIMP-1阳性细胞百分率。

1.6 脑组织含水量检测 取出剩余脑组织，于电子分析天平称其湿重;标本置于100℃烤箱中烘干24 h至恒重，再称其干重。脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重 ×100。

1.7 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组脑组织病理情况比较 观察组大脑皮质水肿明显，细胞变性、坏死，层次混乱;神经元细胞数目减少，细胞外间隙增宽;炎性细胞增多，间质水肿明显。对照组脑组织细胞形态结构清晰完整，细胞核居中、核仁清楚，神经细胞胞体有突起伸出，间质内未见出血、坏死及水肿。

2.2 两组各时点脑组织MMP-9、TIMP-1表达及含水量比较 观察组脑组织MMP-9、TIMP-1表达及含水量均先升高后降低，对照组无明显变化。观察组T0～T5时点脑组织MMP-9、TIMP-1表达及含水量均高于对照组，P均＜0.05。见表1。

表1 两组各时点脑组织MMP-9、TIMP-1表达及含水量比较(n=36， ± s)

表1 两组各时点脑组织MMP-9、TIMP-1表达及含水量比较(n=36， ± s)

注:与同组T0时点比较，*P＜0.05;与对照组同时点比较，#P＜0.05，##P ＜0.01。

组别 MMP-9(%) TIMP-1(%) 脑含水量(g/100 g)74.17 ±0.92观察组T0 13.89 ±1.98# 19.58 ±0.70# 79.11 ±3.64#T1 32.56 ±2.81*## 32.43 ±2.30*## 83.42 ±1.74*#T2 42.40 ±3.53*## 27.71 ±1.46*## 85.29 ±2.24*#T3 33.90 ±2.11*## 26.18 ±1.77*## 85.04 ±1.70*#T4 31.55 ±2.13*## 17.59 ±1.66*## 81.34 ±2.38*#T5 2.75 ±0.25＊＊# 7.94 ±0.58*## 76.84 ±2.17*#对照组T0 2.08 ±0.21 1.80 ±0.17 73.74 ±1.89 T1 2.07 ±0.19 1.85 ±0.21* 74.61 ±2.23 T2 2.05 ±0.22 1.90 ±0.17* 74.35 ±1.32 T3 2.18 ±0.30 1.92 ±0.20* 73.48 ±1.82 T4 2.10 ±0.27 1.94 ±0.12* 73.52 ±1.55 T5 2.09 ±0.26 1.97 ±0.19*

3 讨论

MMPs在生理条件下主要以无活性的酶原形式存在，在脑缺血及炎症介质的刺激下可转化为活性成分［8］。其中，与 BBB破坏关系最为密切的是MMP-9［9，10］，其对于毛细血管基膜的破坏可能是神经炎症反应所致BBB损伤的一条最终共同通路［11］。Rosenberg等［12］发现，MMP-9 通过降解毛细血管基底膜而破坏BBB，产生继发性组织损伤，且活性MMP-9的出现与BBB开放时间一致。Gasche、Fujimura 等［13，14］发现，早期活化的 MMP-9 是导致BBB破坏和VBE形成的主要原因。因此，MMP-9激活导致BBB通透性改变，是HIBD过程中VBE形成和继发性脑损伤的关键因素。

TIMP-1可由巨噬细胞、角质细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞合成，是MMPs的内源性组织抑制因子，主要从两个方面抑制MMPs活性。在酶原活化阶段，TIMP可与MMPs形成稳定复合物而阻碍MMP的酶原自我激活;在活化的MMPs阶段，可直接与活化的MMPs形成紧密的1∶1复合体而抑制其活性。TIMP-1可与MMP-9特异性结合，形成可溶性非共价复合物，从而在蛋白水平调节其活性。最近研究发现，TIMPs不仅是MMPs抑制剂，还可能在MMPs的激活级联过程中扮演重要角色。但是，国内对于二者是否参与了缺血性脑血管病后BBB损害和VBE形成，以及在此过程中的变化规律等方面的研究甚少，在新生儿HIBD领域也少有报道。

本研究发现，观察组大脑皮质水肿明显，细胞变性、坏死，神经元细胞数目减少，炎性细胞增多;而对照组脑组织细胞形态结构清晰完整，间质内未见出血、坏死及水肿。同时本研究中，观察组脑组织含水量呈先升高后降低趋势，各时点脑组织含水量均显著高于对照组，说明在HIBD过程中有明显的脑水肿形成。观察组脑组织MMP-9表达先升高后降低，且时相变化与BBB第二次双相开放模式的时间一致;说明MMP-9参与了BBB的破坏过程，是VBE形成的主要机制之一。本研究中，观察组脑组织TIMP-1表达也是先升高后降低，但是与MMP-9表达变化并不完全平行，其高峰时段存在差异，可能与HIBD过程中诱导MMP-9大量表达时TIMP-1的耗竭有关［15，16］。因此，HIBD 新生大鼠脑组织 MMP-9和TIMP-1表达升高，且呈时间依赖性，二者可能与HIBD过程中血管源性脑水肿的形成有关。

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