一例犬布鲁氏菌病的诊断

丁妙霞，叶惠仪，黄江志，黄炳炽，钟群芳，张险朋

（1.广东省东莞市横沥镇农业技术服务中心，广东 东莞 523460；2东莞市动物疫病预防控制中心，广东 东莞 523086）

一例犬布鲁氏菌病的诊断

丁妙霞1，叶惠仪1，黄江志1，黄炳炽2，钟群芳2，张险朋2

（1.广东省东莞市横沥镇农业技术服务中心，广东 东莞 523460；2东莞市动物疫病预防控制中心，广东 东莞 523086）

布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌属的细菌感染引起的一种人畜共患性传染病，是一种以长期发热、关节疼痛、肝脾肿大和病程慢性化为主要特征的机体变态反应性疾病。本病分布广泛，且有抬头趋势，给畜牧业和人的健康带来较大的危害。目前，流产布氏杆菌（牛种菌，Brucella abortus）、猪种菌（B.suis）、马尔他布氏杆菌（羊种菌，B.melitensis）和犬种菌（B.canis）对人类致病，且其致病力有所差异。中心近期接诊一例怀疑为布鲁氏菌感染的犬只，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料中心在2015年4月27日接诊一只犬，根据主诉，品种为贵宾，年龄3岁，从当地宠物店购买，2015年3月14日配种，2015年4月24日出现流产，送到当地的一间宠物诊所求诊，该诊所用快速检测试纸条检测为布鲁氏菌抗体阳性，初步怀疑是布鲁氏菌病。

1.2 病料采取犬全血离心分离血清，4℃保存待检，用棉拭子采集阴道分泌物用50%甘油PBS液放4℃保存待检。

1.3 试剂布鲁氏菌病虎红抗原购自美国IEDXX公司，批号：382-10。布鲁氏菌试管凝集抗原购自中监所，批号：150138011。布鲁氏菌病荧光PCR试剂盒购自上海之江生物技术有限公司，批号:H20150401。

1.4 方法

（1）虎红平板凝集试验方法按照《动物布鲁氏菌病诊断技术》GB/T 18642-2002操作，在虎红平板凝集板上加30μl血清，在受检血清旁边加30μL抗原，用牙签搅动血清和抗原使之混合，用时设阴性、阳性血清对照。在阴性、阳性血清对照成立的条件下，对被检血清进行判定，受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象判为阳性，无凝集现象判为阴性。

（2）试管凝集试验方法按照《动物布鲁氏菌病诊断技术》GB/T 18642-2002操作。

（3）荧光PCR方法取50μL样本，加50μL核酸提取液充分混匀，沸水浴10min，然后13000rpm离心10min，去上清4μL作为PCR反应模板。按照每个反应体系35μL布鲁氏菌核酸荧光PCR检测混合液与1μL内部对照品，以及0.4μL酶，加入4μL提取的PCR反应模板。荧光PCR反应参数为，37℃，2min；93℃，15s，60℃，60s，循环40次。阳性对照FAM通道CT值小于或等于35，阴性对照无扩增曲线试验成立，样品FAM通道小于或等于38判为阳性。

2 结果

2.1 虎红平板凝集试验结果用虎红平板凝集试验进行初

筛，检测血清，肉眼可见凝集现象，血清抗体阳性。

2.2 试管凝集试验结果采用试管凝集试验对虎红平板凝集试验阳性的血清进行确认，抗体滴度达到1：100，确定为布鲁氏菌抗体阳性。

2.3 荧光PCR结果采用荧光PCR方法检测阴道分泌物，阳性质控ct值为19.5，样品ct值为21，阴性质控无扩增曲线，样品布鲁氏菌病阳性，详见图1。

3 讨论

根据血清学和病原学检测的结果，结合临床症状，初步诊断为该犬只感染布鲁氏菌病，也是东莞市首次检测到犬的布鲁氏菌病。布鲁氏菌的病原学诊断主要是从血液或者感染的组织中分离培养布鲁氏菌来确诊。布鲁氏菌的分离培养是诊断布鲁氏菌病的金标准，但是由于布鲁氏菌的分离率比较低，容易污染，若加上抗生素，则分离效率更低，此外，分离所需要的时间比较长，至少3～8d，有时甚至达45d。另一方面，分离布鲁氏菌对实验室环境和要求较高并存在生物安全风险，需要在生物安全防护级别比较高的才能进行分离培养。鉴于实验室的条件，此次试验未对荧光PCR检测为阳性的样品进行分离培养。此次试验采用荧光PCR方法检测阴道分泌物结果为阳性，证明应用荧光PCR方法检测布鲁氏菌是可行的，荧光PCR具有灵敏性和特异性高，能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点。目前，已广泛应用于分子生物学和医学研究等领域，特别是近几年来在动物疫病的诊断中得到了广泛的应用。凝集试验是布鲁氏菌病诊断的一种常用的方法，包括血清凝集实验、乳环沉淀试验和抗人免疫球蛋白试验，其中标准试管凝集试验是我国的法定的检测方法。虎红平板凝集抗原是用抗原性良好的布鲁氏菌菌株经培养，灭活，离心收集菌体后用虎红染料染色后悬浮于乳酸缓冲液中制成，该方法灵敏度高，价格便宜，操作方便，检测快速，适于动物群体布鲁氏菌病的普查。在国际贸易中是牛、羊、猪布鲁氏菌病检测的指定试验，在我国也用于动物布鲁氏菌病监测的初筛。

布鲁氏菌病对人的危害不同种类的布鲁氏菌大多具有不同宿主间交叉感染的能力，并具有极为明显的宿主危害倾向性。人类布鲁氏菌病主要来自动物，主要是通过接触发病及带菌动物和被布鲁氏菌污染的畜产品而感染。犬的布鲁氏菌病是人感染该病的传染源之一，犬的布鲁氏菌对人类具有致病性，虽然犬的布鲁氏致病性不及羊种、牛种和猪种，但也对公共卫生构成很大的威胁。对于该犬只检出布鲁氏病，建议对该犬只实施安乐死，并进行无害化处理，加强对环境的清洁和消毒。同时，要加强对家畜布鲁氏菌病的监测，摸清家畜中布鲁氏菌感染的情况，为布鲁氏菌病的防控、净化奠定基础。

图1 荧光PCR方法检测样品布鲁氏菌病结果图

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10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．08.085