围绝经期妇女PD-1的表达及意义

吴 静王 琳凌 晨祁松楠赵瑞珂顾国浩▲

1.江苏省盐城市妇幼保健院检验科，江苏盐城 224002；2.苏州大学附属第一医院检验科，江苏苏州 215006

围绝经期妇女PD-1的表达及意义

吴 静1王 琳2凌 晨2祁松楠2赵瑞珂2顾国浩2▲

1.江苏省盐城市妇幼保健院检验科，江苏盐城 224002；2.苏州大学附属第一医院检验科，江苏苏州 215006

目的 探讨围绝经期妇女外周血单个核细胞共刺激分子PD-1mRNA和T细胞表面PD-1分子的表达和意义。 方法 采用Taqman探针实时荧光定量PCR法、流式细胞术检测70例围绝经期、40例绝经后期和30例育龄期组外周血单个核细胞PD-1mRNA的表达。 结果 PD-1mRNA的表达在三组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），与育龄期组相比，围绝经期组及绝经后期组PD-1mRNA表达量均显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；T细胞表面PD-1的表达在三组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），围绝经期及绝经后期组CD4+T细胞和CD8+T细胞的PD-1水平低于育龄期组（P＜0.05）。 结论 共刺激分子PD-1的异常表达可能与围绝经期妇女免疫功能失调有关。

围绝经期；实时荧光定量PCR；流式细胞术；免疫功能；PD-1

在大多数妇女老龄化的进程中，围绝经期是一个必经的重要时期。围绝经期是指从接近绝经出现与绝经有关的内分泌、生物学和临床特征起至最后1次月经后1年内的时期。处于围绝经期的妇女由于卵巢功能衰退，神经、内分泌及免疫系统均会出现紊乱而引起一系列相应的临床症状，如出现潮热、出汗、情绪不稳定、心悸、胸闷、失眠等症状。目前的临床研究多集中于围绝经期妇女相关激素水平的研究，对该期妇女的免疫功能方面的研究相对较少。共刺激信号对于机体维持免疫功能稳态具有重要作用，程序性死亡受体1（programmeddeath1，PD-1）是一种重要的共刺激分子，为CD28超家族成员，与其相应的配体结合后发挥负性免疫调节作用。本课题选取了与免疫功能相关的重要分子PD-1，运用实时荧光定量PCR技术检测其mRNA表达，流式细胞术检测其在T细胞表面的表达。从转录和翻译水平探讨围绝经期及绝经后期妇女免疫功能的变化。

1　资料与方法

1.1一般资料

收集2013年6月～2014年1月于苏州大学附属第一医院及盐城市妇幼保健院高级体检中心体检的140例健康妇女血清，年龄19～73岁。其中，围绝经期组70例，平均年龄（42.5±3.6）岁，入选标准为出现月经不规律现象到停经1年内的妇女；绝经后期组40例，平均年龄（53±7.3）岁，入选标准为停经1年以上的妇女；育龄期组30例，平均年龄（34.4±6.8）岁，入选标准为月经周期正常的育龄期女性。排除标准：（1）有肝、肾等内科疾病者；（2）有免疫系统或内分泌系统疾病者；（3）有妇科器质性病变或曾行卵巢切除术者；（4）服用激素类药物及半年内有外科手术史者；（5）2周内曾患急性感染性疾病者。

表1　PCR引物序列及产物片段大小

1.2主要仪器及试剂

Trizol试剂（Ambion公司），Ficoll淋巴细胞分离液（上海恒信试剂公司），RNA逆转录试剂盒（天根公司），RealMaster Mix试剂盒（天根公司），eppendorf—centrifuge 5430R低温高速离心机（德国eppendof公司），GeneAmp PCR System9700扩增仪（美国ABI公司）、LightCycler 480Ⅱ扩增仪（Roche公司），Thermo Spectronic紫外分光光度计（美国Spectronic），鼠抗人CD3-FITC荧光素标记单克隆抗体，鼠抗人CD8-Pe-CY7荧光素标记单克隆抗体，鼠抗人PD-1-PE荧光素标记单克隆抗体，溶血剂（溶血素∶蒸馏水=1∶9），IgG-PE同型对照，溶血剂（溶血素∶蒸馏水=1∶9）（单克隆抗体均购自美国BD公司），流式细胞仪FACSC Calibur型（美国BD公司）。

1.3方法

1.3.1标本收集 月经周期规则者于周期3天抽血，已绝经者可随时抽血，所有研究对象均于清晨空腹时抽取静脉血5mL，乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na2）抗凝备用。

1.3.2外周血单个核细胞分离 取Ficoll淋巴细胞分离液3mL于试管中，吸取稀释好的外周血沿管壁缓缓加入淋巴细胞分离液中，水平离心机2000rpm离心20min，吸取中间层云雾状单个核细胞1.5mL于离心管中，10000rpm离心1.5min，弃上清，加入1mL生理盐水混匀，10000rpm离心1.5min，弃上清，加RNAisoRegent混匀，于-80℃低温冰箱保存备用。

1.3.3总RNA提取 加入200μL氯仿，猛烈颠倒混匀20次，冰浴5min，低温离心机4℃，12000rpm离心6min，取上清至1.5mLEP管中，加入异丙醇500μL颠倒混匀，冰浴5min，低温离心机4℃，12000rpm离心6min，弃上清，加入1000μL75%乙醇（0.1%DEPC水配制）混匀，低温离心机4℃，12000rpm离心5min。弃去上清后倒置室温干燥15min，加20μL 0.1%DEPC水溶解。1∶50稀释提取的总RNA，使用紫外分光光度计检测在260nm、280nm处光密度值（OD值），比值在1.8～2.0之间，说明完整性良好。

1.3.4逆转录 反应体系（40μL）：Rnase Free ddH2O 19μL，Reverse Transcriptase M-MLV（200u/μL）1μL，5×Reverse Tanscriptase M-MLV Buffer8ul，dNTP Mixture（10mM）2μL，Random 9 mers（200u/μL）4μL，RNAsafe（20×）2μL，Total RNA 4μL。将上述 反应体系 混匀，于GeneAmp PCR System9700扩增仪上42℃ 60min，95℃ 5min，4℃ 1min进行反应，合成的cDNA保存于-80℃冰箱备用。

1.3.5标准品制备 采用本室制备的β-actin质粒标准品，浓度分别为3.34×108、3.34×107、3.34×106、3.34×105、3.34×104copies/mL。

1.3.6引物与探针设计及合成 引物与探针均由上海闪晶生物技术研究所设计并合成，见表1。

1.3.7实时荧光定量PCR反应 将逆转录形成的cDNA、阴性对照、质粒标准品使用LightCycler 480 Ⅱ扩增仪进行扩增，反应体系（25μL）：ddH2O 10μL，2.5×realMasterMix 10μL，正向引物（5pmol/μL）1μL，反向引物（5pmol/μL）1μL，探针（5pmol/μL）1μL，20×Probe Ehancer solution 1μL，模版1μL。设置循环反应参数：94℃预变性1min；94℃ 20s，60℃ 30s，68℃ 1min，共计40个循环。根据空白对照调整扩增基线，根据标准的扩增曲线计算每个标本的基因表达量。采用相对定量法，用内参基因β-actin将目的基因PD-1校正至108copies/mL，取校正后目的基因拷贝数的对数为最终有效数据来进行统计分析。

1.3.8流式细胞术检测T细胞表面分子的表达 将EDTA-Na2抗凝外周血混匀备用，每个样本准备2个流式管，每管加入50μL的全血，2个流式管中依次加入20μL CD3/CD8/PD-1和CD3/CD8/IgG-PE同型对照管，振荡混匀，室温避光孵育15min，加入1mL溶血剂，振荡混匀，室温避光孵育12min，加入1mL的PBS，振荡混匀，1500rpm/min离心5min，弃上清，加入300μL PBS，重悬细胞，上机分别测定CD4+、CD8+和CD4+、CD8+T淋巴细胞表面PD-1的表达。

1.3.9外周血淋巴细胞绝对值的检测 使用全自动血细胞分析仪检测淋巴细胞绝对值（×109/L），淋巴细胞计数值与流式细胞获得的PD-1表达率相乘得到PD-1分子的表达量（×106/L）。

1.4统计学分析

使用SPSS17.0统计软件进行分析，数据正态分布检验使用Kolmogorov-Smirnov检验法，正态分布资料以表示，非正态分布资料以中位数（四分位数）表示；组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）和Kruskal-Wallis H检验，两样本均数的比较采用t检验和Mann-Whitney U检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表2　研究对象外周血T表面共刺激分子PD-1表达量[或M（P25～P75）]

表2　研究对象外周血T表面共刺激分子PD-1表达量[或M（P25～P75）]

注：与育龄期组比较，aP＜0.05

围绝经期组　　绝经后期组　　育龄期组　　统计量　P CD4+PD-1+（%）　8.96±4.9a　8.95±1.76a　12.69±2.21　10.99　　＜0.05 CD4+PD-1+（×106/L）　140.98（97.89～209.65）a168.23（120.21～196.89）a　248.56（211.32～295.65）　38.65　　＜0.05 CD8+PD-1+（%）　6.24±3.28a　5.44±1.50a　7.17±2.02　19.99　　＜0.05 CD8+PD-1+（×106/L）　121.23±50.32a　104.01±35.21a　150.23±65.23　9.65　　＜0.05

2　结果

2.1围绝经期和绝经后期妇女外周血单个核细胞表面共刺激分子PD-1 mRNA表达

PD-1mRNA的表达在三组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），围绝经期组PD-1 mRNA的表达量为（5.07±0.88），绝经后期组PD-1 mRNA的表达量为（5.46±0.68），育龄期组PD-1 mRNA的表达量（4.43±0.89），与育龄期组相比，围绝经期组及绝经后期组PD-1mRNA表达量显著增高（P＜0.05）。见图1。

2.2围绝经期和绝经后期妇女外周血T细胞表面共刺激分子PD-1的表达量分析

外周血T细胞表面PD-1分子相对表达率（%）和绝对值（×106/L）在三组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），CD4+T细胞PD-1相对表达率（%）和绝对值（×106/L）在围绝经期和绝经后期均低于育龄期组（P＜0.05），CD8+T细胞的PD-1的相对表达率（%）和绝对值（×106/L）在围绝经期和绝经后期均低于育龄期组（P＜0.05）。见表2，图2。

图1　围绝经期、绝经后期和育龄期组PD-1 mRNA表达比较

图2　围绝经期、绝经后期和育龄期组T细胞表面PD-1表达量比较

3　讨论

围绝经期（perimenopausal period）是指妇女从临床上或血中激素水平开始出现卵巢功能衰退的征兆至最后1次月经后1年的时期[1]。围绝经期的平均年龄段在45～55岁之间，约持续5年左右，近年来有提前的趋势，围绝经期以卵巢功能衰退，雌激素水平降低为主要特征，可伴随出现一系列退行性改变如月经紊乱、骨质疏松症、心血管疾病、生殖道肿瘤等。雌激素受体可分布于女性多个部位组织和器官的细胞膜上，雌激素水平低下使这些组织和器官发生退行性变，引起心脑血管系统、泌尿生殖系统等的功能紊乱。胸腺是人体重要的中枢免疫器官，胸腺的萎缩直接影响机体的细胞免疫功能，同时对体液免疫也有一定影响[2]。PD-1是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员，PD-1与其相应的配体结合可参与如病毒感染，自身免疫性疾病，肿瘤等多种病理进程[3-5]。以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等有重要的意义。近年来，通过阻断PD-1信号通路来治疗各种肿瘤的研究也取得了很大的进展[6-11]，显示了PD-1在机体免疫功能研究中不容忽视的地位。

PD-1分子其与配体PD-L1结合能产生负向刺激信号，导致T淋巴细胞功能受到抑制，增殖、活化及分泌细胞因子能力降低[11]。在许多慢性病毒感染中，PD-1/PD-L1发挥着很重要的作用，有研究发现患者在抗病毒治疗前CD8+T淋巴细胞表面PD-1显著高于治疗后和健康对照组[12]，表明PD-1分子与机体免疫功能状态密切相关。本研究以PD-1分子为出发点，着重研究外周血单个核细胞PD-1mRNA的表达及T细胞表面PD-1分子的表达，从不同层面探讨其变化与妇女围绝经期的关系。本次研究中发现：围绝经期和绝经后期妇女PD-1mRNA表达显著升高，因此我们推测绝经后妇女T淋巴细胞功能受到抑制，并可能导致免疫功能紊乱。但是我们发现：围绝经期和绝经后期妇女T细胞表面PD-1表达量显著低于育龄期组，这与mRNA的表达结果不一致，推测该分子在转录和翻译水平的表达不同，这为进一步研究PD-1的表达机制提供了一定的线索。有学者发现：多发性硬化症小鼠模型经雌激素治疗后T细胞表面PD-1的表达存在剂量效应关系， 提示雌激素可能通过上调T细胞PD-1的表达发挥免疫抑制功能[13]。有研究显示[14]，胸腺细胞及外周血单个核细胞上均存在性激素受体，性激素通过与受体结合发挥作用。由于绝经期妇女雌激素水平降低，与T细胞表面的雌激素受体结合能力也随之减弱，导致CD4+PD-1+、CD8+PD-1+的表达量下降。由此我们推测，围绝经妇女雌激素水平下降对PD-1可产生一定的影响。

综上所述，围绝经期及绝经后期女性存在内分泌激素和细胞免疫功能的紊乱、外周血共刺激分子PD-1表达异常与其免疫功能紊乱可能存在一定的联系。同时，共刺激分子的表达在转录阶段与翻译阶段存在一定的差异，其调控网络复杂，有待进一步研究探索。

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The expression and significance of PD-1 inperimenopausal and postmenopausal women

WU Jing1WANG Lin2LING Chen2QI Songnan2ZHAO Ruike2GU Guohao2
1.Department of Clinical Laboratory,Maternal and Child Health Hospital,Yancheng 224002,China;2.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,China

Objective To investigate the expression of PD-1 mRNA in peripheral blood mononuclear cells and the expression of PD-1 on T cells in perimenopausal and postmenopausal women. Methods The mRNA expression of PD-1 mRNA were detected by Taqman probe real-time quantitative PCR,and the levels of PD-1 on T cells were determined by Flow Cytometry.The subjects in the study included 70 perimenopausal women,40 postmenopausal women and 30 childbearing age women. Results The expression ofPD-1 mRNA differed significantly in these three group(P＜ 0.05),compared with the childbearing age group,PD-1 mRNA level in postmenopausal women and postmenopausal women was significantly increased(P＜0.05);The expression ofPD-1 on T cells differed significantly in these three group(P＜0.05),compared with the childbearing age group,PD-1 level in postmenopausal women and postmenopausal women was significantly decreased(P＜0.05). Conclusion The abnormal expression of PD-1 may be closely related to the immune dysfunction of perimenopausal women.

Perimenopausal women;Real-time quantitative PCR;Flow Cytometry;Immune function;PD-1

R711.51

A

2095-0616（2015）09-13-05

▲

（2015-02-05）