半巢式RT—Realtime PCR检测番茄丛矮病毒

粟智平++杨益娥++赵伟铎++李金庆++邓丛良++尹伟力

摘要 番茄丛矮病毒（ToBSV）是我国进境植物检疫对象，也是进境种子苗木等必检项目。该病毒能侵染番茄、曼陀罗、葡萄、豇豆等20余科120余种植物。该研究根据ToBSV全基因组中p33蛋白基因，设计引物和TaqMan探针，建立了半巢式实时PCR检测ToBSV的新方法。该研究巧妙地融合了巢式PCR和TaqMan探针技术，第二步半巢式-RT-Realtime PCR既进一步放大了第一步检测信号，也是对第一步PCR产物的确认，与单一的巢式PCR或Realtime PCR等方法相比其检测的准确性、灵敏度更高。该方法检测灵敏度可达50 fg/μL植物总RNA。

关键词 番茄丛矮病毒（ToBSV）；半巢式RT-Realtime PCR；检测

中图分类号 S41-30 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）18-0148-03

Dectection of Tomato Bushy Stunt Virus by Semi-nested RT-Realtime PCR

SU Zhi-ping 1 YANG Yi-e 2 ZHAO Wei-duo 1 LI Jin-qing 1 DENG Cong-liang 3 YIN Wei-li 1

（1 Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yantai Shandong 264000； 2 Huitong County Agriculture Bureau of Hunan Province；

3 Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau）

Abstract Tomato bushy stunt virus（ToBSV）is a plant quarantine object in China，and it is a required inspection item for the imported grapes and so on.This virus can infect 120 kind of 20 families of plants，such as tomato，Datura stramonium L.，grape and cowpea.Three nested primers and one TaqMan probe were designed according to the p33 protein gene of the ToBSV，with which we set up a new method of semi-nested RT-Realtime PCR to detect the ToBSV.The nest-PCR and the probe-detection technique were combined maneuverably in this study.The semi-nested RT-Realtime PCR in the second step can both magnify the sigal and validate the result of the first step，which can provide a more sensitive and specific detection of the ToBSV.The sensitivity of the method can reach 50 fg/μL of total plant RNA.

Key words tomato bushy stunt virus（ToBSV）；semi-Nested RT-Realtime PCR；dectection

番茄丛矮病毒（ToBSV）属番茄丛矮病毒科番茄丛矮病毒属病毒[1]。该病是我国对外制种的检疫对象，也是进境葡萄等种子苗木必须施检的项目。近年来，为了促进我国葡萄业及葡萄酒产业的壮大，我国从美国、法国、意大利等进口大量葡萄苗。这些葡萄苗大都来自番茄丛矮病毒的疫区，极有可能携带有该病毒，因此，开发出快速、灵敏检测ToBSV的技术意义重大。

ToBSV病毒粒体为球状，直径30 nm，正20面多角体，分散在细胞质和液泡内。其体外存活期为几周，致死温度为80～90 ℃条件下10 min。该病毒能侵染番茄、曼陀罗、葡萄、豇豆等20余科120余种植物[2]。苗期受害后，初有环状坏死斑出现，叶片褪绿且掉落。如果苗期施用氮肥过多，在茎组织中发展很快，茎部变软，引起猝倒。系统症状表现为顶部坏死或幼叶卷曲，有丛生或侧芽增生。病株底部叶片褪绿和变紫，番茄成熟果实上除有褪绿斑之外，还可产生平行斑或环斑。

ToBSV在积水的土壤条件下经汁液传毒进入寄主植株。尚未明确侵染方法，但可能通过损伤的根细胞侵入。ToBSV即使通过人、畜的消化道也不能被消化，不改变其传染性，因此人和动物被推断认为是该毒原的一种传播途径。此外，采用污水和淤泥作为肥料时，有可能传播该病毒[3]。

目前，免疫电镜、寄主症状和酶联免疫吸附测定（ELISA）等是国内外检测番茄丛矮病毒的重要方法之一[4]。但各种检测技术均有弊端。该文提供了一套“半巢式反转录实时荧光PCR（即半巢式-RT-Realtime PCR）”检测ToBSV的分子技术，该项检测技术具有更快速、简便、准确、灵敏等特点。

1 材料与方法

1.1 试验材料

番茄丛矮病毒（ToBSV）、藜草花叶病毒（SoMV）、草莓潜环斑病毒（SLRSV）、番茄黑环病毒（TBRV）和桃丛簇花叶病毒（PRMV），核酸由中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所提供。endprint

核酸蛋白分析仪为BioPhotometer（德国eppendorf公司）；实时荧光PCR基因扩增仪为ABI PARISM 7000（美国ABI公司）；纳米磁珠法植物总RNA提取试剂盒由北京出入境检验检疫局提供；实时荧光PCR试剂盒（PlatinumR定量 PCR SuperMix-UDG，货号：C11730-025）购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒（货号：DRR037A）购自大连宝生物公司（TaKaRa）。

1.2 TaqMAN探针与引物的设计合成

在NCBI中查询到ToBSV全基因组中p33蛋白基因（p33 protein）序列保守区域，根据该区域分别设计3条引物（1条上游引物与2条下游引物）和1条TaqMan探针。上游引物用ToBSVF表示，其序列为：5′-TCCATACCAATCATAC CGCTGTT-3′，下游引物用ToBSVR表示，其中ToBSVR1序列为：5′-TAGTTCATTGCCAAAAGCCTTGA-3′，ToBSVR2序列为：5′-AGGCACCCTGACATTGAACG-3′。探针用ToBSVP表示，序列为5′（FAM）-ATGCCACTAGGGTACGCGCAGTCT CA-3′（TAMARA）。PCR产物长度ToBSVF/ToBSVR1为78 bp，ToBSVF/ToBSVFR2为99 bp。3条引物及探针可以组成2套不同的反应组合，套1为ToBSVF/ToBSVR1/ToBSVP，套2为ToBSVF/ToBSVR2/ToBSVP。

1.3 总RNA提取及质量控制

分别从感染上述病毒的叶片及健康葡萄叶片（CK1）中用纳米磁珠法植物总RNA提取试剂盒提取总RNA，为了获得其浓度与纯度值，测定其OD值（核酸蛋白分析仪BioPhotom-eter），并以此控制核酸质量。

1.4 反转录合成cDNA

用反转录试剂盒DRR037A分别将“1.3”中提取的6个植物总RNA及DEPC水对照（CK2）进行反转录操作，以合成cDNA。反应体系参照参考文献[4-6]。

1.5 实时荧光PCR试验

1.5.1 特异性试验。进行引物探针特异实时荧光PCR试验，模板分别是“1.4”中合成的7个cDNA。反应体系：在25 μL体系中分别加入PCR buffer（2×）12.5 μL，上游引物ToBSVF（15 μmol/L）1 μL，下游引物ToBSV R1（或ToBSVR2）（15 μmol/L）1 μL，探针（ToBSVP）（10 μmol/L）1 μL，ROX 0.5 μL，cDNA 2.0 μL，补充DEPC水至25 μL，每个模板设置至少2个重复；循环条件：50 ℃、2 min；95 ℃、2 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，45 cycles；在ABI PARISM 7000仪器的96孔板中进行反应[7-8]。

1.5.2 灵敏度试验。用灭菌水后的DEPC处理水将从感染番茄丛矮病毒（ToBSV）的植物叶片中提取的总RNA分别稀释为10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1及DEPC水11个梯度，进行反转录合成cDNA，然后进行实时荧光PCR灵敏度试验。实时荧光PCR与反转录操作同前所述。

1.5.3 2套引物探针的扩增效率对比试验。为比较这2套引物探针的扩增效率，用同一个ToBSV病毒cDNA为模板，分别用套1组合（ToBSVF/ToBSVR1/ToBSVP）和套2组合（ToBSVF/ToBSVR2/ToBSVP）进行实时荧光PCR试验。实时荧光PCR操作同前。

2 结果与分析

2.1 特异性试验PCR扩增结果

套1（ToBSVF/ToBSVR1/ToBSVP）PCR扩增结果见图1、套2（ToBSVF/ToBSVR2/ToBSVP）PCR扩增结果见图2。从图1、2可以看出，除了在以ToBSV的cDNA为模板的反应体系中出现了标准的扩增曲线外，其他6种cDNA模板均未出现扩增信号，与预计的结果相符合，2套引物探针均具有良好的特异性。

2.2 灵敏度试验PCR扩增结果

用DEPC处理水稀释为10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、DEPC水11个梯度，稀释从带ToBSV的叶片中提取植物总RNA。反转录分别合成cDNA后，进行实时荧光PCR扩增。套1和套2结果见图3、4。可以看出，当RNA稀释至10-7（即5 fg/μL）时，检测不到信号，因此该方法检测的灵敏度可达10-6，即50 fg/μL植物总RNA。

2.3 套1、套2引物探针的扩增效率对比试验结果

2套引物探针：套1组合（ToBSVF/ToBSVR1/ToBSVP）和套2组合（ToBSVF/ToBSVR2/ToBSVP）的扩增效率对比试验结果见图5。可以看出，2套引物探针的扩增效率几乎完全一样。

3 结论与讨论

该研究根据番茄丛矮病毒（ToBSV）全基因组中p33蛋白基因，设计引物和TaqMan探针，建立了半巢式实时PCR检测ToBSV的新方法。该研究巧妙地融合了巢式PCR和TaqMan探针技术，第二步半巢式-RT-Realtime PCR既进一步放大了第一步检测信号，也是对第一步PCR产物的确认，检测灵敏度可以达到50 fg/μL植物总RNA。与单一的巢式PCR或Realtime PCR等方法相比其检测的准确性、灵敏度更高，同时也解决了由于不同方法而导致2次结果差异大、对结果难以判定的问题，能有效减少国际贸易中可能出现的贸易争端[9-10]。

4 参考文献

[1] RUSSO M，BURGYAN J，MARTELLI G P.Molecular biology of tombusv-iridae[J].Adv Virus Res，1994，44：381-428.

[2] 燕飞，宋雪梅，成卓敏.番茄丛矮病毒p19蛋白抑制转录后基因沉默作用机制[J].病毒学报，2005，21（5）：403-405.

[3] 洪健，周雪平.植物病毒的电镜诊断[J].电子显微学报，1999，18（3）：39-46.

[4] 朱建裕，朱水芳，廖晓兰，等.实时荧光RT-PCR一步法检测番茄环斑病毒[J].植物病理学报，2003（4）： 338-341.

[5] 赵文军，安德荣.番茄环斑病毒HC-RT-PCR-ELISA检测[J].微生物学报，2003（2）： 174-179.

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[8] 郑元仙，刘雅婷.番茄斑萎病毒属病毒检测技术研究进展[J].云南农业大学学报（自然科学版），2009（4）： 607-613.

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[10] 王盛，王杨，李志英，等.TBSV病毒瞬时表达载体构建及其表达[J].宁夏大学学报（自然科学版），2011（2）：159-163.endprint