顶空气相色谱－质谱联用结合同位素峰形校正检索技术鉴别芝麻油风味成分

马育松，王 敬，艾连峰，窦彩云，贾海涛，于 猛

(1．河北出入境检验检疫局，河北 石家庄 050051;2．河北农业大学 食品科技学院，河北 保定 071000)

芝麻油又称麻油、香油，是以芝麻为原料加工制取的食用植物油［1－2］，其性质稳定，广泛应用于食品、医药、化妆品、金属及印染等领域［3］。芝麻含油质量分数约为50%(其中油酸和亚油酸占85%，蛋白质约25%)，还含有大量的硬脂酸、棕榈酸、花生酸和亚麻酸等。由于不饱和脂肪酸含量很高，所以芝麻油有提高脑细胞活力、改善血液循环、延缓衰老等功能［4］。同时，芝麻油还含有多种天然抗氧化剂，包括芝麻酚、芝麻素、芝麻酚林、芝麻素酚、芝麻林素酚和维生素E等［5］，比其他植物油更易保存。由于芝麻油的市场售价远高于大豆油、棉籽油等常见食用植物油，部分生产及经营者为牟取暴利，在芝麻油中掺入廉价的油脂(如菜籽油、棉籽油、棕榈油等);或直接用香精和香料勾兑优质油品，以降低生产成本，牟取暴利;甚至将禁用的有毒、非食用的矿物油、桐油、大麻油等掺入油脂中，或将过期变质油品掺入合格油品以次充好［6］。这些行为严重侵害了消费者的合法利益并且扰乱了正常的市场秩序，使得芝麻油质量问题越来越受到社会的关注。

芝麻油的风味成分由浓度极低、种类繁多且结构复杂的各种挥发性物质组成，目前普遍采用气相色谱－质谱(GC－MS)对其风味成分进行分析［7］，该技术利用保留时间和NIST谱库检索对目标物进行定性。然而，仅靠谱库检索来推断化合物的元素组成存在很大的不确定性，往往会出现NIST库检索匹配率不高，或几个待选物的匹配率相似等情况。自然界中很多元素(如C，H，O和N等)都有固定的同位素，每种同位素在自然界的丰度为一个固定值，因此可将质谱图中同位素峰的相对丰度用于精确相对分子质量的校正技术。近年来美国Cerno Bioscience公司利用同位素规律开发出一种软件(Mass-WorksTM)用于校正计算精确相对分子质量［8］，该软件通过建立校正函数方程，并将同位素效应、仪器噪音过滤、峰形补偿纳入函数方程中，经过计算校正质谱轮廓图，可以在单位分辨质谱上测定精确质量数，并利用其独有的同位素峰形校正检索技术(CLIPs)，准确识别目标物的分子式［9］。目前该方法已在药物分子及代谢产物的鉴定、环境与安全和农兽药的定性研究中得到应用，但在食用油的定性分析中未见报道。本文采用顶空气相色谱－质谱法测定了市售芝麻油的挥发性风味成分，利用MassWorksTM技术同时校正精确质量数和同位素峰形，探索了一种在低分辨率单四极杆质谱仪上对芝麻油风味成分进行快速、灵敏和可靠定性分析的方法，为进一步对芝麻油掺伪的鉴别提供了可靠依据。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

Agilent GC－MS 7890A/5975C气相色谱－质谱联用仪(配Agilent 7697A自动顶空进样器，美国安捷伦公司)，20 mL顶空瓶(美国安捷伦公司)。

1.2 芝麻油样品

实验用油为石家庄农贸市场或超市购得的50批次芝麻香油。制油工艺包括水代法和压榨法;原料品种包括黑芝麻和白芝麻;产地包括河北、山东、河南、广东、坦桑尼亚和山西等地。

1.3 实验方法

取10 mL芝麻油于20 mL顶空瓶中，用橡胶密封垫及铝盖封口，放入顶空进样器中，按程序加热平衡后，顶空气体由GC－MS进行分析。实验通过优化样品体积、挥发温度、平衡时间及程序升温等条件，选取最佳仪器分析条件。

1.4 仪器条件

顶空程序:顶空平衡温度200℃，定量管温度210℃，传输线温度220℃;平衡时间:20 min。

色谱条件:DB－624(60 m×0.25 mm×1.4 μm)毛细管色谱柱;进样口温度:250℃;载气流速:1 mL/min;程序升温:初始温度60℃，保持5 min，以10℃/min升至100℃，保持5 min，以5℃/min升至250℃，保持5 min;分流比:5∶1。

质谱条件:离子源(EI)温度:230℃;四极杆温度:150℃;传输线温度:250℃;阈值:0;扫描方式:原始扫描;质量扫描范围:30～400 Da。以全氟三丁胺(PFTBA)标准品为外标对质谱进行校正。

1.5 数据处理

用MassWorksTM校正质量轴和质谱峰形，是获得精确质量数的关键。通过校正，可以将原始的质谱图转变为校正质谱图，并确定目标物的精确质量数;再经过同位素峰形校正检索技术(CLIPs)实现目标物分子式的准确识别。以MassWorksTM软件用标记的PFTBA平均质谱图为基准，对质量轴和质谱峰形进行校正，建立校正函数，PFTBA具有丰富的碎片分布，可对40～550 Da全部的质谱图进行校正。然后利用MassWorksTM软件将校正函数运用到芝麻油的一级全扫描Profile质谱图进行校正计算，获得目标物的精确质量数，将校正函数应用到GC－MS采集的质谱数据中，以获得高的谱图精度并准确识别目标物分子式。

2 结果与讨论

2.1 芝麻油的主要挥发性成分

按照优化的实验条件对芝麻油中的挥发性成分进行分析，得到了挥发性成分的总离子流图(见图1)。利用NIST 08标准谱库检索对挥发性成分进行初步定性，以MassWorksTM质谱解析软件对质谱图进行校正，模拟计算出组分的精确分子质量，经CLIPs检索得到组分的元素组成。综合两种分析方法的结果，并按照峰面积归一化法计算出各组分的相对百分含量，最终确定市售芝麻油风味成分中的71种化合物，占总检出化合物的90.2%(见表1)。这些成分主要包括14种醛类、13种吡嗪类、9种呋喃类、5种吡咯类、4种噻唑类、6种酚类、2种吡啶类、2种吲哚类、2种酸类、1种醇类、1种酯类、1种唑类、1种噻吩类、4种烃类、3种酮类和3种含硫化合物。其中，含量较大的4类物质为醛类(37.4%)、酚类(20.1%)、吡嗪类(10.0%)和呋喃类(6.7%)。这些物质的协同作用形成了芝麻油的特有风味。

图1 芝麻油挥发性成分的总离子流图Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile compounds of sesame oil

醛类物质因感官阈值一般较低，对芝麻油香味的整体贡献较大。正己醛在醛类物质中含量最高，达12.8%，其次是壬醛、顺-2-庚烯醛和反，反-2，4-癸二烯醛。醛类具有脂肪和水果等香气特征，还可能表现出辛辣的刺激性气味［10－11］。例如，己醛呈现生的油脂和青草气及苹果香味，常存在于苹果、草莓、茶叶、苦橙、咖啡中。烯醛具有油脂香、清香、果香。壬醛能散发出类似玫瑰花香气的气味。

吡嗪类物质具烘烤、坚果香、咖啡、肉香等香气特征，占芝麻油挥发性风味物质的10.0%，是芝麻油香气的主要成分［12］。其中，含量较高的吡嗪类物质有2-甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪和2-乙基-5-甲基吡嗪。含氮的吡嗪类物质主要通过美拉德反应生成。吡嗪类物质的香气感官阈值较低，香气的扩散性较好，香味浓郁。如甲基吡嗪具有坚果香、霉香、烤香和壤香。

呋喃类物质是芝麻油具有特殊风味的重要因素之一。其中，2-戊基呋喃的含量最高，达到3.4%，其次是5-甲基糠醛、2-糠醇和糠醛。呋喃类物质具焦甜气味，使含有这种物质的食品呈现浓郁的烤芝麻油香甜味，其中最能体现芝麻油香甜味特征的物质是2-糠醇。

酚类物质的含量较高，其中芝麻酚的含量最高，达到16%，酚类化合物呈现似木香、烟熏香和焦香;含硫类物质也是芝麻油风味成分中不可缺少的一类物质，一般带有类似新鲜洋葱的味道，主要通过热降解含硫氨基酸生成;噻唑类物质所占的比例很低，这类物质在浓度高时有特殊臭味，但浓度很低时具有牛肉香味、爆玉米、坚果、烘烤花生等香气，可能是半氨酸或胱氨酸分解物与糖的分解产物相互作用的结果;其他几类化合物，如吡啶类、吡咯类、噻吩类、吲哚类、唑类、醇类、酸类、酯类和烃类等，虽然每类物质个数少，含量低，但也是芝麻油风味成分不可或缺的物质。因此，芝麻油的香味是多种物质协同作用的结果。

表1 芝麻油的主要挥发性成分分析(n=50)Table 1 Identification of main volatile compounds in sesame oil(n=50)

(续表1)

(续表1)

2.2 质谱解析结果的分析

将MassWorksTM软件和谱库检索技术相结合用于未知物的质谱解析，尤其是对于谱库检索匹配度不高的化合物，不仅能充分发挥MassWorksTM准确识别元素组成的优势，而且能快速确定化合物结构，使质谱解析的结果更加可靠。另外，MassWorksTM还可根据其独有的同位素峰形校正检索功能(CLIPs)，通过建立元素组成已知的一个或多个离子生成的校正函数，对质谱峰的精确质量数和同位素峰形同时进行校正匹配，以实现对目标物分子式的准确识别，从而大大提高了低分辨质谱定性的准确度［13-16］。例如，34.063 min的5-甲基-1H-吡咯醛，其NIST谱库检索结果并不理想，匹配度仅为9.47%，排在检索结果中的第5位。而在图2和表2 MassWorksTM的结果中，其分子式排在11个候选分子式的第1位，谱图准确度为98.583 7%，且得到不饱和度值为4的信息也进一步对结果进行确证，从而实现了目标物分子式的准确识别。由此可见，排序最高的化合物并不一定是目标物，而通过MassWorksTM校正得到的谱图准确度和质量精度为GC－MS谱库检索提供了高度可靠的确证。对于互为同分异构体的正丁醛和异丁醛、正戊醛和异戊醛等物质，MassWorksTM与高分辨质谱仪(如:TOF和Orbitrap)一样，仅依据精确质量数和元素构成，无法完成对异构体的准确识别，需通过其他方法来辅助确定其结构，文中涉及到的几种同分异构体，是通过利用各自的标准物质进行色谱分离后，根据不同的保留时间加以确证。

图2 MassWorksTM测定5-甲基-1H-吡咯醛分子式结果Fig.2 Formula results of 1H-pyrrole-2-carboxaldehyde，5-methyl-by MassWorksTM

表2 5-甲基-1H-吡咯醛的CLIPs检索匹配结果Table 2 The CLIPs results of 1H-pyrrole-2-carboxaldehyde，5-methyl-

3 结论

芝麻油的风味成分主要为吡嗪、呋喃、吡咯、吡啶、噻吩、吲哚、唑等杂环化合物以及酚类、硫醇、硫醚等化合物，这些化合物对芝麻油的香味有着不同的贡献，芝麻油的特殊风味是多种成分协同作用的结果。在本文建立的色谱条件下，可以完成对芝麻油中71种风味成分的分析;同时，通过解析芝麻油风味成分的质谱数据可知，仅依靠质谱谱库检索来确定未知化合物是不够的，同位素峰形校正检索技术通过模拟计算出的精确分子量，可准确地确定化合物的元素组成，不仅弥补了低分辨率四极杆质谱的不足，也为芝麻油挥发性成分的分析提供了新思路。

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