联麦氧钒对糖尿病大鼠内质网应激介导心肌细胞凋亡的抑制作用及其机制

李 颖，丛晓强，赵良臣，谢 林，刘 娅

（1.吉林省人民医院急诊内科，吉林 长春 130021；2.吉林大学第一医院心内科，吉林 长春 130021；3.吉林省吉林市中心医院心内科，吉林 吉林 132011；4.吉林大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，吉林 长春 130021）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种在世界范围流行的重要疾病，已成为严重影响我国国民健康的公共卫生问题。最新数据［1］显示：截至2012年中国DM患病人数已达9240万以上，居世界第一，DM前期患者已高达1.48亿，预计到2030年中国DM患者将增至约1.3亿。目前DM已成为人类第4大死亡原因，占全球总死亡率的6.8%［2］。1974年糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）的概念被首次提出，其是独立于高血压、冠心病和心脏瓣膜病的心肌病，目前认为是导致DM患者死亡的主要原因［3］。钒是一种具有独特化学性质和生物活性的人体必需微量元素，联麦氧钒 ［bis（maltolato）oxovandium，BMOV］是一种有机钒络合物，研究［4－5］显示：BMOV可促进糖原合成，增加肌肉、脂肪等胰岛素敏感组织对葡萄糖的摄取和利用，并对胰岛素抵抗和高胰岛素血症造成的靶器官如心肌、视网膜有一定的保护作用。在胰岛β细胞中钒通过对内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的调节抑制细胞凋亡，因而有理由假设钒可能参与调节心肌细胞中ERS介导的细胞凋亡，从而起到保护心肌细胞的作用。本实验通过构建大鼠DM模型，给予饮水中加入BMOV，探讨BMOV对DM大鼠ERS介导的心肌细胞凋亡的干预作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器 健康雄性清洁级Wistar大鼠35只，体质量200～220g，购于吉林大学实验动物部；将大鼠置于吉林大学公共卫生学院毒理学研究所饲养，每笼2只，室温控制在17～21℃，控制昼夜光照。饲料购自吉林大学实验动物中心；BMOV购自上海笛柏化学品技术有限公司，产品编号H 129021；链脲佐霉素（STZ）购自美国Sigma公司；TUNEL试剂盒购自锐博生物有限公司；GADPH、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）抗体购自英国Abcam公司，CCCAAT／增强子结合慢白同源蛋白（CHOP）抗体发光试剂购自上海碧云天生物试剂公司；X盒结合蛋白1（XBP－1）抗体购自美国Sigma公司；qPCR引物为上海生工合成；qPCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。UV－265可见－紫外光分光光度计（日本岛津公司）。

1.2 实验分组、模型建立和给药 对照组：随机取10只大鼠腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液（pH 4.5，浓度0.1mmol·L－1）＋正常饮水＋常规喂养，维持4周。其余25只大鼠一次性腹腔注射STZ建立DM动物模型［6］，浓度为40g·L－1，剂量为55mg·kg－1，1周后检测大鼠空腹的尾静脉血糖，血糖≥13.3mmol·L－1定为 DM 大鼠，STZ诱导过程中5只大鼠未达DM成模标准，予以剔除，取成模20只大鼠随机分为DM组和BMOV组，每组10只。DM组大鼠正常饮水＋常规喂养，继续维持3周；BMOV组大鼠饮水中加入BMOV（将BMOV溶解在饮水中，起始饮水中BMOV 浓度为 0.25g· L－1，每3d增加0.25g·L－1，第9天达最高浓度1g·L－1，保持不变）＋常规喂养，共维持3周［7］。

1.3 TUNEL染色观察大鼠心肌组织细胞凋亡情况 大鼠在3%戊巴比妥30mg·kg－1腹腔注射麻醉后，取左心室心肌组织，取一部分10%甲醛固定2d后行预处理，按试剂盒说明书，将组织切片脱蜡，梯度酒精浸洗，Proteinase K工作液透化，在切片上加TUNEL反应液，盖膜，37℃孵育60min，PBS缓冲液冲洗3次，DAB室温显色10min，PBS洗涤3次，每次5min，梯度酒精脱水、透明和封片，于光镜下观察，每只大鼠3张切片，每个切片随机计数无重叠具有代表性的5个400倍视野，以平均每100个细胞核中含凋亡细胞数量作为心肌细胞凋亡指数（apoptosis index，AI）［8－9］。

1.4 Western blotting法检测心肌组织中GRP78、CHOP和XBP－1表达水平 取部分新鲜左心室心肌组织，液氮研磨组织至单细胞状态，加入裂解液（每10mg组织加入200μL，含PMSF），冰上裂解30min；4℃、12000r·min－1，离心15min，取上清，考马斯亮蓝G250测定蛋白质溶液的吸光度（A）值，调整样品的蛋白浓度，使各个样品的浓度在同一水平（4～8g·L－1）。实验采用不连续系统蛋白质SDS－PAGE，浓度为5%浓缩胶和15%浓度分离胶；每孔上样40～60μg总蛋白，蛋白质相对分子质量标准为普通Marker，相对分子质量范围为16000～220000。实验选用Bio－Rad的标准湿式转膜装置及PVDF膜，转膜完毕后，TBST溶液中漂洗1～2min，5%脱脂奶粉封闭液，室温，50r·min－1，封闭60min。孵育一抗：根据蛋白Marker指示将PVDF膜剪开，参考一抗说明书，按1∶1000（GRP78）、1∶1500（CHOP）和1∶1000（XBP－1）比例稀释一抗；将PVDF膜分别放入含各自一抗溶液中，4℃孵育一抗过夜。孵育二抗：参考二抗说明书加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1∶5000比例稀释），室温摇动孵育1h。使用BeyoECLPlus化学发光试剂，黑暗处显色，用X光片压片，显影液和定影液洗片。

1.5 qPCR法检测XBP－1mRNA表达水平 取部分新鲜冰冻左心室心肌组织，采用Trizol法提取总RNA，参考TaKaRa PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（D6210A）试剂盒说明书进行反转录。XBP－1引物序列为上游：5′－AGTTAAGGACACGCTTGGGG－3′，下游：5′－ACGTAGTCTGAGTGCTGCG－3′。内参 GAPDH 的引物序列为上游：5′－CACTCAGAAGACTGTGG－3′，下游：5′－TTCAGCTCTGGGATGACCTT－3′。反转录合成cDNA，反应参数参考TaKaRa SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）试剂盒说明进行，Real－Time PCR的扩增曲线和融解曲线应用 Bio－Rad CFX96Real－Time PCR System的操作方法进行，以目的基因XBP－1与内参照基因GADPH值的比值表示目的基因相对表达水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0及Excel 2010软件进行统计学处理。各组大鼠体质量、空腹血糖水平、 AI和GRP78、 CHOP、 XBP－1、XBP－1mRNA表达水平均以表示，组间两两比较采用Student－Newman－Keuls检验。

2 结 果

2.1 各组大鼠基本情况 对照组：整个实验过程中对照组大鼠生长及精神状态良好，体质量明显增加，空腹血糖正常，皮毛色泽正常，反应敏捷。DM组：大鼠腹腔注射STZ成模后逐渐出现多饮、多尿、多食和消瘦（三多一少）等症状，与对照组比较，第2～4周大鼠体质量降低（P＜0.05），血糖明显升高（P＜0.05），精神萎靡，皮毛脏乱无光泽。BMOV组：大鼠腹腔注射STZ成模后，第2周饮水中加入BMOV，大鼠多饮、多尿、多食和消瘦症状较DM组明显好转，第2～4周大鼠体质量明显增加（P＜0.05），血糖明显下降（P＜0.05），精神尚可，皮毛干枯。见表1和2。

表1 各组大鼠体质量Tab.1 Body weights of rats in various groups （n＝10，，m／g）

表1 各组大鼠体质量Tab.1 Body weights of rats in various groups （n＝10，，m／g）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with DM group.

1 2 3 4 Control 216.60±8.20 295.40±13.00 331.36±18 Group Body weight（week）.14 365.17±15.63 DM 213.54±7.20 178.09±13.98＊ 175.30±14.42＊ 185.94±15.99＊BMOV 214.87±7.36 236.18±16.87＊△ 248.04±20.99＊△ 262.66±20.13＊△

表2 各组大鼠空腹血糖水平Tab.2 Levels of fasting glucose of rats in various groups ［n＝10，，cB／（mmol·L－1）］

表2 各组大鼠空腹血糖水平Tab.2 Levels of fasting glucose of rats in various groups ［n＝10，，cB／（mmol·L－1）］

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with DM group.

1 2 3 4 Control 5.18±0.36 5.35±0.36 5.47±0.29 5.21±Group Fasting glucose（week）0.35 DM 23.66±3.16 26.71±3.05＊ 27.94±1.91＊ 29.22±2.89＊BMOV 24.02±3.21 18.60±2.08＊△ 16.51±0.67＊△ 16.26±1.09＊△

2.2 各组大鼠心肌细胞凋亡情况 TUNEL法检测结果显示：对照组大鼠心肌组织中见极少的凋亡细胞（细胞核呈棕黄色为凋亡细胞，呈淡蓝色为正常细胞），AI为（0.80±0.63）%；DM组AI为（9.10±1.79）%；BMOV组AI 为（5.20±1.75）%。与对照组比较，DM组和BMOV组大鼠心肌细胞AI明显升高（P＜0.05）；与DM组比较，BMOV组大鼠心肌细胞AI明显下降（P＜0.05）。

2.3 各组大鼠心肌组织中 GRP78、CHOP和XBP－1表达水平 与对照组比较，DM组和BMOV组大鼠心肌组织中GRP78、CHOP和XBP－1表达水平明显升高（P＜0.05）；与DM组比较，BMOV组大鼠心肌组织中GRP78、CHOP和XBP－1表达水平明显降低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠心肌组织中GRP78、CHOP和XBP－1表达水平Tab.3 Expression levels of GRP78，CHOP，and XBP－1in myocardium tissue of rats in various groups（n＝10，）

表3 各组大鼠心肌组织中GRP78、CHOP和XBP－1表达水平Tab.3 Expression levels of GRP78，CHOP，and XBP－1in myocardium tissue of rats in various groups（n＝10，）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with DM group.

GRP78 CHOP XBP－1 Group 2 Control 0.106±0.0110.274±0.0220.361±0.02 DM 0.207±0.014＊0.530±0.065＊0.499±0.055＊BMOV 0.153±0.010＊△0.364±0.031＊△0.419±0.032＊△

2.4 各组大鼠心肌组织中XBP－1mRNA表达水平与对照组（1.00±0.21）比较，DM组（3.10±0.29）和BMOV组（2.60±0.24）大鼠心肌组织中XBP－1mRNA表达水平明显升高（P＜0.05）；与DM组比较，BMOV组XBP－1mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）。

3 讨 论

DCM 是一个长期而 复杂的病理过程［10－11］，其由能量代谢异常导致细胞内质网、线粒体和肌原纤维等损伤，最终导致心肌细胞肥大和凋亡增加，进一步加重DCM过程中心肌重构与功能障碍。内质网存在于所有真核细胞中，是真核细胞蛋白质、胆固醇、脂类合成、信号转导、信号肽识别及钙稳态维持的亚细胞器，参与新合成的分泌性蛋白和跨膜蛋白的糖基化修饰、折叠、寡聚化等过程，对细胞内环境变化极度敏感。当细胞在高糖诱导下，能量代谢紊乱，内环境稳态受到破坏，内质网内未折叠蛋白过度蓄积，极易触发ERS［12］。XBP－1是ERS中非折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）元件重要的转录调控因子，当细胞发生ERS时，内质网腔内重要跨膜蛋白分子IRE1与GRP78分离，发生寡聚糖化、自身磷酸化而激活，诱 导 XBP－1mRNA特异性剪接，产生XBP－1smRNA，编码XBP－1s蛋白，进入细胞核中与ERS反应顺式作用元件结合，在转录水平上调控ERS相关基因的表达，启动相关的细胞凋亡信号［13－14］。

近年研究［15－16］显示：钒化合物具有明确的类胰岛素样活性，是一种很有前途的降糖药物，其对DM大鼠的心肌损害和心功能具有明显的保护作用，其可能的作用机制一直是研究的热点和争论的焦点。本研究中BMOV组大鼠血糖水平较DM组明显降低，表明BMOV有降血糖作用；经TUNEL染色后DM组大鼠心肌细胞凋亡较对照组明显增加，GRP78、CHOP和XBP－1蛋白表达水平升高，XBP－1mRNA表达上调，表明在DM大鼠中ERS及其介导的细胞凋亡参与DCM的发生发展过程，并能够加重心肌细胞损伤；BMOV组大鼠心肌细胞AI较DM组明显降低，GRP78、CHOP和XBP－1表达明显降低，XBP－1mRNA表达下调，表明BMOV对DM大鼠心肌细胞具有保护作用，其作用机制可能与抑制心肌细胞ERS及其介导的细胞凋亡有关联［17－18］，但是否是通过降低血糖实现的，尚需进一步研究。

本研究结果提示：临床针对DCM的治疗，除了有效控制血糖外，更应进一步探寻潜在的、多层次的、多通路的联合治疗策略，减轻DM患者心肌病变的损伤。对于早期DM患者，可以考虑适当增加富含钒类食物如海鲜等的摄入，以改善患者的预后，提高其长期生存率。

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