带黑素细胞的组织工程化表皮膜片移植治疗白癜风的初步临床研究

李剑 吴文育 陈淑君 傅雯雯 徐金华 Taro Uyama 徐昱 项蕾红

带黑素细胞的组织工程化表皮膜片移植治疗白癜风的初步临床研究

李剑 吴文育 陈淑君 傅雯雯 徐金华 Taro Uyama 徐昱 项蕾红

目的 评估体外培养含黑素细胞自体表皮膜片移植技术治疗稳定期白癜风的临床有效性和安全性。方法 18～65岁皮肤科门诊稳定期白癜风患者，切取患者3～7.5 cm2正常皮肤组织，根据Green方法进行表皮组织片培养，约3周角质形成细胞形成具有一定张力的表皮片组织，即进行手术移植；术后患处加压包扎，2周后拆线，术后进行随访，并用Wood灯分析色素恢复情况，记录复色情况及不良反应，评价治疗效果。结果2012年2-12月共入组患者15例，年龄18～62岁，随访时间12～24个月，失访1例。15例白癜风患者中6例达到100%复色，且均为节段型白癜风，6例达到75%～100%复色。面颈部患者复色效果优于躯干部位。结论体外培养含黑素细胞的自体组织工程化表皮膜片移植技术用于治疗稳定期白癜风的安全性、有效性都较高，值得临床应用。

白癜风；黑素细胞；组织工程；移植，自体；器官培养技术；修复外科手术；皮肤移植

白癜风外科手术方法主要包括手术切除（含皮肤扩张、皮瓣转移）、皮肤磨削和自体皮肤移植。手术切除和磨削针对小面积的白癜风患者，但是对于皮损面积较大的患者，自体皮肤移植是较为理想的方法。自体皮肤移植分为三类：含黑素细胞的正常皮肤（表皮或表皮和真皮）移植；非培养的含有黑素细胞的表皮或者毛囊移植；生长于附着物的培养的黑素细胞（含有或者不含有角质形成细胞）移植。有学者对自体培养黑素细胞治疗白癜风进行了深入研究，取得了较好的临床效果［1-2］。近年来我国学者在构建组织工程皮肤领域取得了瞩目的成绩［3-4］。2011年底，我科开始进行体外培养组织工程化表皮膜片移植治疗白癜风的探索，取得了较好的治疗效果。现将前期治疗且随访时间较长的白癜风患者治疗恢复情况总结如下。

对象与方法

一、病例纳入标准

2012年2-12月于华山医院皮肤科就诊、临床诊断为稳定期白癜风患者（患者无新发皮损，原有皮损无扩大，无同形反应至少1年）。年龄18～65岁，无严重内科疾病及活动性传染病，无瘢痕体质，术前经多种方法治疗无效，并有意愿进行手术治疗。术前查血常规、出凝血功能、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、快速血浆反应素环状卡片试验及心电图等，排除系统性疾病及传染性疾病，实验室检查正常适合手术者进行手术治疗。本研究经华山医院伦理委员会批准，患者术前签署知情同意书。

二、表皮培养及手术方法

1.表皮组织培养：培养方法同以往研究报道［5］。患者局部浸润麻醉，从下腹部腹股沟处切取（1～1.5）cm×（3～4）cm的正常全层皮肤组织，0.25%胰酶/0.01%EDTA和胶原蛋白酶对皮肤组织进行处理并回收；将回收的表皮细胞接种在用丝裂霉素处理过的不能增殖的滋养细胞层3T3上培养；每2～3 d更换1次DMEM-F12培养液，DMEM-F12培养液由 DMEM（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，加拿大Invitrogen公司）和Ham（Ham′s F12 medium，加拿大Invitrogen公司）3∶1组成，其中添加5%胎牛血清（美国HyClone公司），10μg/L表皮生长因子（美国Austral Biologicals公司），24.3 mg/L腺嘌呤（美国Sigma Chemicals公司），5 mg/L胰岛素（美国Sigma Chemicals公司），0.4 mg/L氢化可的松（美国Calbiochem公司），0.212 mg/L异丙基去甲肾上腺素（加拿大Sandoz公司）。表皮细胞在7～10 d后结成细胞群落，2周左右，表皮细胞融合状态形成后，再培养1周，形成完整的复层表皮细胞（图1）。用倒置显微镜观察和多巴染色法来确认培养的表皮中黑素细胞的生长情况及比例。培养中及移植手术前1周对培养的表皮进行细菌、真菌、支原体、衣原体和内毒素检测。

2.手术方法：移植当天，用纱布将培养成形的表皮从培养皿中剥离，用磷酸缓冲溶液洗净以备移植用；患者皮损处用1%利多卡因、1%肾上腺素局部麻醉后，用电动皮肤磨削机对患处皮肤表层磨削。将培养表皮的基底膜面着磨削区域覆盖；将涂有抗菌药软膏的油纱布（非粘贴性纱布）覆盖于移植部位后进行固定缝合；用纱布固定，以防止手术部位被拉动。移植1周后，替换保护用固定纱布；移植2周后，拆线移除非粘贴性纱布，用涂了抗菌素软膏的纱布覆盖2～3 d后移除纱布，此后每天轻涂抗菌药软膏2次，避免阳光曝晒。移植后的第1、3、6、12个月随访观察，数码相机拍照记录，并用Wood灯分析色素恢复的状况，记录复色情况及不良反应。

图1 培养的皮肤表皮片生长情况 1A：培养成功准备移植的表皮片；1B：多巴染色，可见复层表皮片中的黑素细胞（×400）；1C：培养表皮纵切面，显示复层表皮片，厚度为100μm（HE×200）

结 果

一、患者资料及有效率

15例患者年龄18～62岁，平均28.6岁。病程1.5～49年，平均病程12.1年，稳定时间1～20年，平均稳定时间5.55年。患者中节段型9例，散发型3例，局限型3例。手术部位在面颈部7例，颈部4例，胸前2例，上臂部2例，双下肢1例，其中1例颈部和上臂部同时手术治疗。术后第12个月随访，复色率评估发现，9例节段型白癜风患者中6例达到100%复色（图2、3），3例复色面积75%～100%。3例散发型患者手术效果欠佳，其中1例男性患者术后1个月随访，未见明显复色，后失访；另2例患者术后第12个月随访，复色面积分别为50%～75%和＜50%。3例局限型患者中2例复色面积＞75%，1例＜50%。术后第1、3、6、12个月随访，应用Wood灯检测色素恢复情况，与术前比较可以看到明显的黑素生成，而皮损处则脱失（图3）。

二、培养表皮膜片的扩增倍数及黑素细胞含量

复层表皮片培养平均时间28.67 d，扩增倍数最小14倍，最大扩增到68.8倍，平均扩增35.77倍。本实验中黑素细胞与角质形成细胞的比例在1∶20到1∶30之间。

三、患者随访情况及不良反应

随访患者时间最长24个月，色素恢复情况良好。随着随访时间的延长，可以看到部分患者复色面积逐渐扩大，皮肤颜色更加均匀。患者手术部位无自发性脱色及皮疹复发，无感染、水疱等严重不良反应。1例女性患者胸前锁骨处皮损磨削移植后出现一处长约2 cm的瘢痕，高出皮面，色红，术后3个月最明显，给予外用糖皮质激素软膏，并局部皮损内注射复方倍他米松注射液，每月1次，共2次，1年后随访，瘢痕逐渐变平，18个月时明显变平，呈肤色。供皮区最严重的不良反应为残留瘢痕，由于取皮部位隐蔽，患者均可以接受。

图3 1例左手臂节段型白癜风患者术前及术后随访 3A：左手臂皮损治疗前；3B：术后18个月随访，皮肤颜色复色良好

讨 论

组织工程皮肤的研究最早始于表皮细胞的成功培养。1975年Rheinwald和Green采用3T3细胞作为滋养层，在体外成功连续培养人表皮角质形成细胞［6］。1981年 O′Connor等首次将此种方法培养的自体表皮膜片（cultured epithelial autograft，CEA）用于烧伤创面的修复，获得成功［7］。成功的皮肤移植可以使烧伤后的色素减退复色，说明黑素细胞可以移植到色素脱失皮肤处。1997年，Kumagai和Uchikoshi［5］报道了应用Green方法培养自体表皮膜片，成功治疗了6例不同类型的色素减退患者（白癜风、斑驳病和白化病）。目前，已有多种皮肤产品问世，并用于临床治疗且取得了一定疗效。按照结构的不同，构建的人工皮肤可分为表皮替代物、真皮替代物、复合皮替代物三种类型，本文采用的表皮膜片属于表皮替代物。之前的组织工程皮肤只关注角质形成细胞，而在皮肤科领域尤其是针对脱色素疾病的治疗，则更关注黑素细胞与角质形成细胞之间的关系，使培养的表皮更接近正常，达到美容的效果。

应用培养的表皮片治疗比单纯培养黑素细胞治疗白癜风具有很多优势［8-10］：首先角质形成细胞可以调节黑素细胞的生长和分化；与角质形成细胞共培养可以使黑素细胞保持其生理学特性；培养角质形成细胞比单纯培养黑素细胞更容易在短时间内获得较大的自体培养皮片；在应用此方法的20余年间尚未报告出现肿瘤风险升高。Guerra等［11］应用培养的自体表皮片移植，成功治疗了32例稳定期白癜风患者。除了肢端和腔口部位疗效略差，其他部位的皮损可以达到88%～96%的复色。我们也是采用自体培养含有黑素细胞的复层表皮膜片的方法移植治疗稳定期白癜风患者，15例患者中6例节段型白癜风患者达到100%复色，6例达到75%～100%复色。与传统的表皮吸疱移植、单纯磨削治疗比较，可以1次治疗较大的面积，而供皮区只需要小块皮肤。该方法颜色恢复均匀，较少出现鹅卵石样外观，患者的满意度较高。腔口部位的皮损，如口周，由于固定难度较大，色素恢复情况欠佳，在手术和包扎过程中需要引起重视。

在治疗效果方面，节段型和局限型白癜风患者疗效较好，优于其他患者，这与 Matsuzaki和 Kumagai［12］2013年的研究结果相似。本研究中6例节段型患者达到100%复色，3例局限型患者中2例也都达到75%～100%复色。与其他外科治疗方法一致，节段型和局限型稳定期白癜风患者，在其他治疗方法无效的情况下，可应用自体培养表皮片移植。本研究最长随访24个月，未发现严重不良反应，无自发性褪色出现。远期效果还在进一步观察中。

培养表皮片移植治疗白癜风对培养有较高的要求。好的临床疗效取决于培养表皮中黑素细胞含量的多少。因此在临床应用时需要将培养组织中黑素细胞的含量作为质量控制的主要指标。多巴染色是比较简单易行的方法，染色计数后可以估算黑素细胞和角质形成细胞的比例。在我们的研究中发现，培养表皮片中黑素细胞与角质形成细胞的比例在1∶20～1∶30比较理想，而且容易做到，临床上易收到良好的疗效。

体外培养自体表皮片移植治疗白癜风是一种较好的治疗方法，但也有其局限性，比如培养成本和人工费用均高出常规手术方法；对培养技术的要求较高，尤其临床应用时，要求培养皮片稳定，养成率高且要保证一定的扩增面积；培养周期较长，一般需2～4周时间。在前期的研究中，我们使用3T3细胞作为支架，虽然随着皮片的生长滋养细胞逐渐退化，但在大批临床应用中仍需慎重。2013年后我们开始研发和应用无滋养层的表皮膜片培养方法，并在临床应用。目前随访的患者中发现其对临床疗效无明显影响，且更安全，更适于大规模的开展应用。但目前的研究仍需更多的临床病例以及更长的随访时间，积累更多资料。

［1］张迪敏,洪为松,傅丽芳,等.个体化培养自体黑素细胞移植治疗白癜风［J］.中华皮肤科杂志,2010,43（10）:721-725.

［2］洪为松,傅丽芳,尉晓冬,等.黑素细胞个体化培养体系的建立及应用［J］.中华皮肤科杂志,2011,44（9）:618-622.

［3］董东,许爱娥.组织工程膜在自体黑素细胞移植治疗白癜风中的作用［J］.中国皮肤性病学杂志,2010,24（6）:573-575.

［4］江蕾薇,陆洪光,蔡灵龙.角质形成细胞与黑素细胞体外构建含黑素的组织工程皮肤［J］.中华皮肤科杂志,2011,44（2）:110-113.

［5］Kumagai N,Uchikoshi T.Treatment of extensive hypomelanosis with autologous cultured epithelium ［J］.Ann Plast Surg,1997,39（1）:68-73.

［6］Rheinwald JG,Green H.Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma ［J］.Cell,1975,6（3）:317-330.

［7］Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal cells［J］.Lancet,1981,1（8211）:75-78.

［8］Atiyeh BS,Costagliola M.Cultured epithelial autograft（CEA）in burn treatment:three decades later［J］.Burns,2007,33（4）:405-413.

［9］Njoo MD,Westerhof W,Bos JD,et al.A systematic review of autologous transplantation methods in vitiligo［J］.Arch Dermatol,1998,134（12）:1543-1549.

［10］Olsson MJ,Juhlin L.Long-term follow-up of leucoderma patients treated with transplants of autologous cultured melanocytes,ultrathin epidermal sheets and basal cell layer suspension［J］.Br J Dermatol,2002,147（5）:893-904.

［11］Guerra L,Capurro S,Melchi F,et al.Treatment of"stable"vitiligo by Timedsurgery and transplantation ofcultured epidermal autografts［J］.Arch Dermatol,2000,136（11）:1380-1389.

［12］Matsuzaki K,Kumagai N.Treatment of vitiligo with autologous cultured keratinocytes in 27 cases［J］.Eur J Plast Surg,2013,36:651-656.

2014-05-08）

（本文编辑：周良佳 颜艳）

Transplantation of tissue-engineered epithelial autografts bearing melanocytes for the treatment of vitiligo:a preliminary clinical study

Li Jian*,Wu Wenyu,Chen Shujun,Fu Wenwen,Xu Jinhua,Taro Uyama,Xu Yu,Xiang Leihong.*Department of Dermatology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China

Xu Jinhua,Email:xjhhsyy@163.com

ObjectiveTo evaluate the clinical efficacy and safety of transplantation of cultured epithelial autografts bearing melanocytes for the treatment of stable vitiligo.MethodsFifteen patients aged 18-65 years with stable vitiligo were enrolled into this study from February to December in 2012.Normal skin tissues measuring 3－7.5 cm2in size were harvested from these patients.According to the method described by Green,epidermal cells from these tissues were cultivatedin vitro.After about 3 weeks of culture,keratinocytes formed epidermal grafts with some tension,which were subjected to autologous transplantation followed by compression bandaging.The sutures were removed after 2 weeks.Follow-up was carried out after transplantation.Repigmentation was analyzed by Wood′s lamp,and adverse reactions were recorded.ResultsDuring the 12－24 months of follow-up,1 patient was lost to follow up.Among the 15 patients with vitiligo,6 with segmental vitiligo achieved 100%repigmentation,and another 6 achieved 75%－100%repigmentation.Lesions on the face and neck showed better repigmentation than those on the trunk after the transplantation.Conclusion Transplantation of cultured tissue-engineered epithelial autografts bearing melanocytes is effective and safe for the treatment of stable vitiligo,and worthy of clinical application.

Vitiligo;Melanocytes;Tissue engineering;Transplantation,autologous;Organ culture techniques;Reconstructive surgical procedures;Skin transplantation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.005

上海市科委引导类课题（124119a1002）；上海市“重中之重”重点学科项目；卫生部重点临床专科项目

200040上海，复旦大学附属华山医院皮肤科（李剑、吴文育、陈淑君、傅雯雯、徐金华、徐昱、项蕾红）；日本国立成育医疗中心（Taro Uyama）

徐金华，Email：xjhhsyy@163.com