古代三合土灰浆中蛋清的酶联免疫检测研究

张秉坚，胡文静，张 坤，方世强

（1.浙江大学 化学系，浙江 杭州 310027；2.浙江大学 文物与博物馆学系，浙江 杭州 310027）

能反映古代建筑原始工艺和保存状态的重要材料之一是胶凝材料.在中国古代，石灰是应用最广泛的无机胶凝材料，至少可以追溯到公元前5 000年～公元前3 000 年［1］，蛋清［2］、动物血、糯米等是当时经常使用的有机胶凝材料.

笔者曾比较系统地研究了糯米灰浆［3－8］、桐油灰浆［9－11］、血料灰浆［12］的作用机理，并已研发出1套从古代遗存物中检测微量有机胶凝材料（包括：淀粉、蛋白质、油脂、动物血、糖分）的化学分析方法［13］.但是，当被检样品中含有干扰色（例如黄土），利用颜色鉴别成分的化学分析方法就难以进行.此外，用于有机成分检测的红外光谱法，由于灰浆中SiO2的红外吸收峰与有机物的红外吸收峰在1 000～1 200cm－1处重叠［4］，难以分辨，导致该法也不能进行有效、准确的鉴别.为了研究蛋清和蛋清灰浆的应用历史及作用机理，如何避免颜色干扰？如何在蛋白质大类分析的基础上进一步准确鉴定蛋清成分就成为必须解决的技术问题.能够从复杂样品中准确检测蛋清的有效方法是免疫法，例如利用卵清蛋白抗体与样品中残留抗原结合的特异性，采用酶联免疫吸附法（ELISA）来检测蛋清成分［14－15］.

Arlen等［16］应用ELISA检测出17世纪法国橱柜上绘画颜料的胶结物为蛋清；Laura 等［17］应 用ELISA，在公元前200年～公元50年的古埃及遗存和17世纪意大利圣弗朗西斯教堂壁画中检测出了鸡蛋成分；美国盖蒂保护所（GCI）也采用ELISA 鉴定出古埃及木乃伊棺材残片中使用的动物胶、植物胶和鸡蛋［18］.以免疫法为核心的检测技术具有很高的特异性和灵敏度，但是，该技术还没有应用于古代灰浆等检测的报道.虽然古代灰浆成分复杂，但只要用过蛋清，就会或多或少有所残留.本文针对蛋清蛋白抗原，采用ELISA进行检测，其基本原理（见图1）是利用涂布于孔板固相载体上的抗体和酶标抗体分别与被检样品中抗原分子上2个抗原决定簇结合，形成固体相抗体－抗原－酶标抗体免疫复合物，该复合物的形成量与待测抗原的含量成正比，测定其中的有色物质量（OD值），即可确定待测抗原的含量.

图1 ELISA 基本原理示意图Fig.1 Basic principle of enzyme－linked immunosorbent assay

1 试剂、仪器和样品制备

试剂为RIDASCREEN® FAST Ei／Egg Protein（R6402）试剂盒，HCl和NaOH 溶液.在波长λ＝450nm的条件下，采用R－Biopharm WeLL Reader酶标仪检测样品的光密度OD450nm.

综合中国古代灰浆的各类无机成分，在实验室模拟制作了3 个系列的蛋清灰浆标准样品：（a）Ca（OH）2＋黏土（二者的质量比为1∶1）；（b）黏土；（c）CaCO3粉末.为考察检测限和准确性，本文制备了6种蛋清浓度（质量分数）水溶液.将水溶液与灰土按质量比0.8混合制作成标准样品，在自然条件下老化6个月后备用.蛋清灰浆标准样品中的蛋清浓度见表1.

表1 蛋清灰浆标准样品中的蛋清浓度Table 1 Concentrations of egg white in standard egg white mortar samples

10个蛋清灰浆样品分别为浙江、河南、吉林、甘肃和北京的古城墙或古墓葬灰浆及壁画地仗层.蛋清灰浆样品的具体情况见表2.

2 试验部分

2.1 ELISA

2.1.1 样品处理

所有样品均经过粉碎、研磨并充分混合.称取少量样品（约0.1g），加入适量提取缓冲液，在60℃条件下用超声波处理10min，冷却后将其置于高速离心机中离心10min，取上清液调节pH 值为7备用.

2.1.2 检测过程

（1）将所需数量的孔条插入微孔板架，并记录下各个样品所在位置.（2）将100μL 待测样品上清液加入到相应的微孔中，在室温（20～25℃）条件下孵育10min.（3）倒出微孔中的液体，将微孔板架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去微孔中的液体，然后在每个微孔中加入250μL洗涤缓冲液进行洗涤.（4）在每个微孔中加入100μL稀释后的酶连接物溶液，充分混合，在室温（20～25℃）条件下孵育10min.（5）倒出微孔中的液体，将微孔板架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体，然后在每个微孔中加入250 μL 洗涤缓冲液进行洗涤.（6）在每个微孔中加入100μL底物／发色剂，充分混合后在室温（20～25 ℃）条件下暗处孵育10 min.（7）在每个微孔中加入100μL 反应终止液，充分混合，再加入反应终止液，10min内于450nm 处测量OD450nm.（8）每个样品重复检测3次，OD450nm取平均值.

表2 蛋清灰浆样品Table 2 Ancient mortar samples

2.2 化学分析法

作为对照，先用试剂考马斯亮蓝G－250对10个蛋清灰浆样品进行化学分析检测，详细步骤见文献［13］.

3 结果与讨论

3.1 蛋清灰浆标准样品分析结果

3.1.1 ELISA 分析结果

对于大多数免疫检测来说，阳性样品与阴性样品之间存在1个检测结果的重叠区.为了提高检测方法的灵敏度和特异性，选择合适的临界值至关重要.本文利用试剂盒中不同浓度的标准蛋白样品进行预测试，以确定同等试验条件下检测的临界值，结果见表3，4.试验发现，0.5mg／kg的OD450nm值大约为0mg／kg的OD450nm值2.6倍，满足临界值＝阴性对照×2.1（或＋，－定值）的要求，故本文取检测临界值为0.228.

检测发现，阴性对照组的OD450nm值均低于临界值.可见，ELISA 具有较高的特异性，不会出现假阳性结果.

综合中国古代常见建筑灰浆中出现的各类无机成分，本文重点考察了Ca（OH）2与土混合系列、黏土系列、CaCO3系列无机物中不同浓度的蛋清灰浆标准样品，以确定ELISA 的灵敏度.不同系列不同浓度蛋清灰浆标准样品的ELISA 检测结果见表5.由表5可见，3个系列蛋清灰浆标准样品空白对照组的OD450nm值均低于临界值，其他浓度标准样品的OD450nm值均高于临界值，这说明ELISA 具有较高的灵敏度和很低的检测限，可以实现标准样品最低蛋清浓度（0.003%）的检测.此外，从3类无机物检测结果可以看出，ELISA 不受灰土本身颜色的干扰，完全克服了考马斯亮蓝化学分析法受颜色影响的缺陷，解决了蛋清灰浆样品中蛋清成分的分析检测问题.

表3 标准蛋白样品的ELISA检测结果Table 3 ELISA result in the standard protein samples

表4 阴性对照组的ELISA检测结果Table 4 ELISA result in the negative controls

表5 不同系列不同浓度蛋清灰浆标准样品的ELISA检测结果Table 5 ELISA result in different series and concentrations of egg white standard samples

3.1.2 化学分析结果

作为对照，本文采用考马斯亮蓝化学分析法检测了蛋清灰浆标准样品，结果如图2所示.对于a系列，化学分析检测蛋清的检测限为0.201%～0.808%（见图2（a））；对于b系列，几乎无法观察到明显的颜色变化（见图2（b））；对于c系列，因样品中不含灰土，检测限为0.201%～0.808%（见图2（c））.由此可见，当蛋清灰浆中含有灰土时，由于受其颜色的干扰，使化学分析法检测蛋清的灵敏度较低.

3.2 清蛋灰浆样品检测结果

3.2.1 化学分析检测结果

对于10个清蛋灰浆样品，首先采用考马斯亮蓝化学分析法进行了检测，结果见表5.由于含有灰土，所有考马斯亮蓝溶液颜色较深，导致检测结果难以准确判断.

3.2.2 ELISA 检测结果

以空白对照组样品的OD450nm值校零，当待测样品的OD450nm值高于临界值时定为阳性，低于临界值时定为阴性.

按照2.1.1和2.1.2，采用ELISA 对10个蛋清灰浆样品进行了检测，结果见表6.由表6 可见，莫高窟85窟掉落地仗、杭州六和塔灰浆、莫高窟26窟掉落地仗、东北某墓葬地仗的OD450nm值处于临界值的上缘，即检测结果呈阳性，表明这4 个样品中含有蛋清蛋白，其中莫高窟85 窟掉落地仗样品的OD450nm值最高，含有蛋清成分的可靠性最大.而河南开封城墙灰浆、浙江安吉孝丰城墙灰浆等6个样品的OD450nm值均低于临界值，即检测结果呈阴性，表明这6个样品中没有蛋清蛋白存在.

图2 蛋清灰浆标准样品的化学检测Fig.2 Results of chemical analyses on simulated egg white standard mortars with inorganic binders of a，b and c（from left to right are mortars with concentration 3.333%，0.808%，0.201%，0.048%，0.012%，and 0.003%）

表6 蛋清灰浆样品检测结果Table 6 Texting results of ancient mortar samples

大多数蛋清灰浆样品均经过了上千年的风吹雨打，能残留的有机胶凝物自然很少.针对这类微量有机成分的检测，需要灵敏更高、特异性更强的方法，免疫分析法不失为最佳选择.通过考马斯亮蓝法和ELISA 对10 个蛋清灰浆样品的检测结果比较可见，ELISA 不仅灵敏度更高，而且克服了灰土颜色的干扰，同时还可将目标蛋白质从其他蛋白类物质中鉴别出来，准确检测出其中的蛋清成分，在检测的特异性方面有了较大突破，非常适合于蛋清灰浆样品中蛋清的分析检测.

4 结论

本文利用抗原－抗体免疫反应的高特异性和灵敏度，采用ELISA 首次实现了蛋清灰浆样品中微量蛋清成分的准确检测.ELISA 检测蛋清的最低检出浓度为0.003%，解决了化学分析法检测时容易受样品中灰土颜色干扰的问题，在蛋清检测的特异性方面有较大的突破，为研究蛋清灰浆的成分提供了有效检测技术.

［1］王炜林，张鹏程，李岗，等.陕西白水县下河遗址仰韶文化房址发掘简报［J］.考古，2011（12）：47－57.WANG Weilin，ZHANG Pengcheng，LI Gang，et al.The excavation of site remains of Yangshao Culture in Xiahe site Baishui County Shaanxi，a brief report［J］.Archaeology，2011（12）：47－57.（in Chinese）

［2］勿日汗，崔越岭.鲜卑人祖居嘎仙洞发现远古彩绘岩画长廊［N］.西部时报，2011－04－15（9）.WU Rihan，CUI Yueling.A discovery of ancient rock drawing in Xianbei ancestors Ga Cave site［N］.The Western Times，2011－04－15（9）.（in Chinese）

［3］WEI Guofeng，ZHANG Hui，WANG Hongmin，et al.An experimental study on application of sticky rice－lime mortar in conservation of the stone tower in the Xiangji Temple［J］.Construction and Building Materials，2012，28（1）：624－632.

［4］YANG Fuwei，ZHANG Bingjian，MA Qinglin.Study of sticky rice－lime mortar technology for the restoration of historical masonry construction［J］.Accounts of Chemical Research，2010，43（6）：936－944.

［5］杨富巍，张秉坚，潘昌初，等.以糯米灰浆为代表的传统灰浆—中国古代的重大发明之一［J］.中国科学E 辑：技术科学，2009，39（1）：1－7.YANG Fuwei，ZHANG Bingjian，PAN Changchu，et al.Traditional mortar represented by rice－lime mortar—One of the great inventions in ancient China［J］.China's Scientific E：Science and Technology，2009，39（1）：1－7.（in Chinese）

［6］杨富巍，张秉坚，曾余瑶，等.传统糯米灰浆科学原理及其现代应用的探索性研究［J］.故宫博物院院刊，2008（5）：105－114.YANG Fuwei，ZHANG Bingjian，ZENG Yuyao，et al.A exploratory study of traditional rice－lime mortar on its scientific principle and modern applications［J］.Palace Museum Journal，2008（5）：105－114.（in Chinese）

［7］ZENG Yuyao，ZHANG Bingjian，LIANG Xiaolin.A case study and mechanism investigation of typical mortars used on ancient architecture in China［J］.Thermochimica Acta，2008，473（1／2）：1－6.

［8］曾余瑶，张秉坚，梁晓林.传统建筑泥灰类加固材料的性能研究与机理探讨［J］.文物保护与考古科学，2008（2）：1－7.ZENG Yuyao，ZHANG Bingjian，LIANG Xiaolin.Study on characteristics and consolidation mechanism of historical mortar materials［J］.Sciences of Conservation and Archaeology，2008（2）：1－7.（in Chinese）

［9］FANG Shiqiang，ZHANG Hui，ZHANG Bingjian，et al.A study of the Chinese organic－inorganic hybrid sealing material used in“Huaguang No.1”ancient wooden ship［J］.Thermochimica Acta，2013，551（10）：20－26.

［10］魏国锋，方世强，李祖光，等.桐油灰浆材料的物理性能与显微结构［J］.建筑材料学报，2013，16（3）：469－474.WEI Guofeng，FANG Shiqiang，LI Zuguang，et al.Physical properties and microscopic structure of tung－oil－lime putty［J］.Journal of Building Materials，2013，16（3）：469－474.（in Chinese）

［11］FANG Shiqiang，ZHANG Hui，ZHANG Bingjian，et al.A study of tung－oil－lime putty—A traditional lime based mortar［J］.International Journal of Adhesion ＆ Adhesives，2014，48：224－230.

［12］张坤，张秉坚，方世强.中国传统血料灰浆的应用历史和科学性［J］.文物保护与考古科学，2013（2）：94－102.ZHANG Kun，ZHANG Bingjian，FANG Shiqiang.The application history and scientific nature of blood－based materials in traditional Chinese mortar［J］.Sciences of Conservation and Archaeology，2013（2）：94－102.（in Chinese）

［13］FANG Shiqiang，ZHANG Hui，ZHANG Bingjian，et al.The identification of organic additives in traditional lime mortar［J］.Journal of Cultural Heritage，2013，15（2）：144－150.

［14］MELISSA P，MANUELA V，PITZURRA L.Development of an analytical protocol for a fast，sensitive and specific protein recognition in paintings by enzyme－linked immunosorbent assay（ELISA）［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2011，399（9）：3011－3023.

［15］PALMIERI M，VAGNINI M，PITZURRA L，et al.Identification of animal glue and hen－egg yolk in paintings by use of enzyme－linked immunosorbent assay（ELISA）［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2013，405（19）：6365－6371.

［16］ARLEN H，VICTORIA M，MICHAEL Q.The Use of immunofluorescence microscopy（IFM）and enzyme－linked immunosorbent assay（ELISA）as complementary techniques for protein identification in artists'materials［J］.Journal of the American Institute for Conservation，2006，45（2）：89－105.

［17］LAURA C，MANUELA V，MELISSA P.Immunodetection of proteins in ancient paint media［J］.Accounts of Chemical Research，2010，43（6）：867－876.

［18］郑军.免疫检测技术在文物胶结材料检测中的应用［N］.中国文物报，2009－09－25（7）.ZHENG Jun.The application of immunoassays in cultural relics binders detection［N］.China Cultural Relics News，2009－09－25（7）.（in Chinese）