黄连素对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道炎症的影响

赵 俊 张溪林 何力敏 陈于荦 明凯华

1.广州市第一人民医院老年病科，广东广州 510180；2.广州市第一人民医院检验科，广东广州 510180

黄连素对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道炎症的影响

赵 俊1张溪林1何力敏1陈于荦1明凯华2

1.广州市第一人民医院老年病科，广东广州 510180；2.广州市第一人民医院检验科，广东广州 510180

目的探讨不同剂量黄连素对慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型大鼠气道炎症的影响。方法 50只清洁级雄性Wistar大鼠随机分为生理盐水对照组、COPD模型组和低剂量（25 mg/kg）、中剂量（50 mg/kg）、高剂量（100 mg/kg）黄连素组，每组各10只。通过气管注射内毒素加熏香烟方法建立大鼠COPD模型。采集左肺支气管肺泡灌洗液，利用瑞氏-吉姆萨染色法行中性粒细胞（PMN）、肺泡巨噬细胞（AM）计数；ELISA法检测IL-8、IL-10、IL-17含量。结果COPD模型组大鼠支气管肺泡灌洗液中的PMN、AM计数及IL-8、IL-17含量显著高于生理盐水对照组（P＜0.01）；IL-10含量显著低于生理盐水对照组（P＜0.01）。而不同剂量黄连素干预后PMN、AM计数，IL-8、IL-17水平有不同程度下降（P＜0.01），IL-10水平有不同程度升高（P＜0.01），且黄连素剂量越高，此效应越明显。结论不同剂量黄连素均可抑制COPD模型大鼠的气道炎症，其机制可能与黄连素下调炎症因子IL-8、IL-17水平，增强抗炎因子IL-10水平这一途径有关，且此效应与黄连素剂量呈正相关。

慢性阻塞性肺疾病；黄连素；气道炎症；白细胞介素

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）在我国是一种常见病、多发病，COPD的发病机制复杂，其中多种炎症细胞因子、炎症介质等相互作用所产生的慢性气道炎症被认为是COPD主要发病机制[1]。反复慢性气道炎症可致气道结构破坏、黏液分泌增加，最终气流受限呈不完全可逆。COPD发病率、死亡率较高，治疗费用昂贵，已成为当今广泛关注的公共卫生问题之一。目前临床上治疗COPD的药物疗效有限，寻找到新的药物迫在眉睫，利用细胞因子受体拮抗剂抑制气道炎症可能是今后临床应用的趋势和方向。现已知IL-8主要由单核-巨噬细胞产生，主要的生物学活性是吸引和激活中性粒细胞，导致机体局部炎性反应；IL-10主要由Th2细胞和单核巨噬细胞产生，能够抑制炎症介质产生，具有抗炎作用；IL-17是T细胞诱导的致炎细胞因子，可促进前炎症细胞因子的释放，导致炎性反应持续。研究表明，IL-8、IL-10、IL-17与COPD疾病的发生、发展密切相关[2-3]。我国传统中药黄连素具有广谱抗菌作用，且价格低廉，现发现黄连素还具有较强的抗炎和免疫调节作用[4]。本研究采用大鼠COPD疾病模型，观察不同剂量黄连素对大鼠气道炎症因子IL-8、IL-10、IL-17的影响并探讨其作用机制，为COPD的防治提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

黄连素片（杭州民生药业有限公司），LPSE.coli055：B5（美国Sigma公司），大鼠白介素（IL）-8、IL-10、IL-17酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（美国BPB公司）。

1.2 实验动物分组

由中山医科大学动物实验中心提供健康雄性SPF级Wistar大鼠50只，平均体重（218±12）g，鼠龄11周。随机化原则分为COPD模型组、低剂量黄连素组（25 mg/kg）、中剂量黄连素组（50 mg/kg）、高剂量黄连素组（100 mg/kg）和生理盐水对照组，各10只。

1.3 COPD疾病模型建立

COPD疾病模型建立参考李红梅等[5]的方法，用持续熏香烟加间断气管内注射脂多糖（LPS）方法：COPD模型组分别于第1、14天在大鼠麻醉、固定、暴露声门后将胶管置入气管，经胶管注入LPS 200 μg（1 g/L）。在第2～28天将大鼠置入熏烟箱内，熏5%香烟，每天0.5 h，共28 d。生理盐水对照组不予熏烟，从第1天起每天雾化吸入生理盐水0.5 h。黄连素干预组从第1天起每天1次分别给予黄连素25、50、100 mg/kg灌胃，其余实验操作与COPD疾病模型组一致。

1.4 标本收集

以10%水合氯醛（50 mg/kg）腹腔内注射麻醉大鼠，暴露双肺，无菌细管置入左肺主支气管，行支气管肺泡灌洗，每次注入4 mL 4℃生理盐水，保留3 min后回收经单纯纱布过滤，反复3次。将收集的支气管肺泡灌洗液 （BALF）混匀后于低温离心机中 （4℃，1200 r/min）离心5 min，分装上清液置-80℃冰箱保存备用。沉渣涂于干净玻片上，进行瑞氏-吉姆萨染色（Wright-Gimosa），染色后在光镜下分别进行细胞总数和中性粒细胞、肺泡巨噬细胞分类计数。

1.5 BALF中IL-8、IL-10、IL-17水平测定

按试剂盒说明书进行操作，在分别包被有抗大鼠IL-8、IL-10、IL-17单抗的酶标板上，采用ELISA法检测，分别计算BALF中IL-8、IL-10、IL-17浓度。

1.6 统计学方法

采用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BALF中细胞总数和分类计数

与生理盐水对照组比较，COPD模型组大鼠BALF内的细胞总数、中性粒细胞数、巨噬细胞数明显升高（P＜0.01）；低、中、高剂量黄连素处理后的BALF中细胞总数、中性粒细胞数、巨噬细胞数较COPD模型组不同程度降低（P＜0.01），且黄连素剂量越高，细胞总数、中性粒细胞数、巨噬细胞数越低。见表1。

表1 各组大鼠BALF中细胞总数尧中性粒细胞数尧巨噬细胞数计数比较（×108个/L，）

表1 各组大鼠BALF中细胞总数尧中性粒细胞数尧巨噬细胞数计数比较（×108个/L，）

注：与生理盐水对照组比较，*P＜0.01，与COPD模型组比较，#P＜0.01；COPD：慢性阻塞性肺病

组别 只数 细胞总数 中性粒细胞数 巨噬细胞数生理盐水对照组COPD模型组低剂量黄连素组中剂量黄连素组高剂量黄连素组10 10 10 10 10 1.68±0.22 6.15±0.64*4.25±0.23#2.72±0.39#2.12±0.46#0.09±0.01 0.57±0.12*0.23±0.04#0.18±0.06#0.10±0.08#0.84±0.52 4.58±0.31*3.02±0.56#1.57±0.28#1.12±0.25#

2.2 BALF中细胞因子IL-8、IL-10、IL-17水平的变化

与生理盐水对照组比较，COPD模型组大鼠BALF中的细胞因子IL-8、IL-17水平明显升高，IL-10水平明显下降，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。而不同剂量黄连素处理后IL-8、IL-17水平较COPD模型组有不同程度降低 （P＜0.01），IL-10水平有不同程度升高（P＜0.01），且黄连素剂量越高，此效应越明显。见表2。

表2 各组大鼠BALF中IL-8尧IL-10尧IL-17水平比较（ng/L，）

表2 各组大鼠BALF中IL-8尧IL-10尧IL-17水平比较（ng/L，）

注：与生理盐水对照组比较，*P＜0.01，与COPD模型组比较，#P＜0.01；COPD：慢性阻塞性肺病；IL：白介素

组别 只数 IL-8 IL-10 IL-17生理盐水对照组COPD模型组低剂量黄连素组中剂量黄连素组高剂量黄连素组10 10 10 10 10 3.34±1.24 10.16±2.86*8.36±1.22#6.72±2.39#5.05±1.61#4.23±0.36 2.30±0.51*3.23±0.34#5.82±0.23#6.10±0.08#35.62±2.32 54.36±3.21*50.02±2.06#42.55±4.20#31.14±3.71#

3 讨论

COPD是一种可预防、可治疗的常见慢性呼吸系统疾病，其以气道持续气流受限为特征，呈进行性发展，晚期可导致肺心病和呼吸衰竭，与气道和肺脏对有害颗粒或有害气体的慢性异常炎性反应增强有关，其发病机制复杂，现已明确气道炎症是COPD的主要病理生理特征，炎症细胞释放的多种细胞因子在COPD气道炎症的发生与发展中具有重要作用[1]。故国内外学者对COPD气道炎症研究也越来越深入。

IL-8是一种趋化细胞因子，由中性粒细胞、淋巴细胞、肺泡巨噬细胞等分泌，可促进中性粒细胞和T淋巴细胞的趋化。IL-8能吸引中性粒细胞在呼吸道募集和激活，释放蛋白水解酶，产生氧自由基及花生四烯酸等系列炎性介质，促进气道炎性反应，引起气道重塑致气流受限，并在一定程度上反映气道炎症的严重程度[6]。而中性粒细胞本身又是IL-8重要来源，两者之间相互促进，具有协同作用，所以IL-8与中性粒细胞与COPD气道炎症密切相关。徐东等[7]发现，在COPD患者血液、痰液中IL-8的水平升高，且与中性粒细胞水平呈一定正相关性。Bhowmik等[8]发现COPD患者的痰液、肺泡灌洗液中IL-8水平较正常人明显升高，且与炎症细胞总数及中性粒细胞数、巨噬细胞数呈正相关。本研究结果显示COPD模型组大鼠BALF中细胞因子IL-8水平较生理盐水对照组明显升高，与国内外学者研究结果相一致，说明IL-8可促进COPD模型组大鼠气道炎症的发生、发展。

IL-17是新近发现的细胞因子，主要由CD4+T淋巴细胞、单核细胞等分泌的一种前炎症细胞因子，在中性粒细胞的募集和激活中发挥着强大的化学趋化作用。IL-17与多种细胞因子和炎症介质产生协同作用以放大炎性反应，导致炎症瀑布效应。体外研究发现，IL-17与其他前炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子（TNF-α）产生协同作用，能促进IL-6、IL-8、细胞黏附分子-1等的产生[9]。Barczyk等[10]发现，在慢性支气管炎和哮喘急性发作期患者的痰液标本中IL-17水平明显增加。本研究结果显示，与生理盐水对照组比较，COPD模型组大鼠BALF中细胞因子IL-17水平明显升高。同时也发现，相对于生理盐水对照组，COPD模型组大鼠BALF中的IL-8水平明显升高，说明IL-17、IL-8在COPD模型组大鼠气道炎症中可能共同发挥作用，是COPD患者发病的重要致炎因子，相互促进，加速气道炎症的发生、发展。

与IL-8、IL-17促炎因子不同，IL-10是一种有效的抗炎因子，主要由Th2细胞、活化的B细胞、单核巨噬细胞产生，参与免疫应答和免疫调节，在感染性、自身免疫性疾病、肿瘤及移植免疫等多种疾病中发挥重要作用，其生物学功能主要是抑制单核细胞、巨噬细胞产生致炎介质，促进抗炎介质的增加。有研究表明，IL-10还能抑制与破坏肺弹性纤维有关的基质金属蛋白酶[11]。有研究者认为，COPD患者血清和肺组织中IL-10的水平低下可能与COPD的发生、发展有关[3]。朱峥等[11]发现，在COPD急性加重期患者吸入激素及激素联合β受体激动剂治疗前后诱导痰IL-10的水平存在差异，治疗后诱导痰IL-10水平升高更为明显。李晓莉等[12]发现，在重度稳定期COPD患者吸入沙美特罗/氟替卡松治疗90 d后的呼出气冷凝液中IL-10水平较治疗28 d显著升高，提示IL-10可能有拮抗气道炎症的作用，有望成为一种抗炎药物用于慢阻肺的治疗。本研究结果显示，COPD模型组大鼠BALF中细胞因子IL-10水平较生理盐水对照组明显下降，表明IL-8、IL-17作为促炎因子，IL-10作为抑炎因子，它们之间的表达平衡失调可能在COPD气道炎性反应中起着重要作用。

随着人口的老龄化、空气污染的日益加剧，我国COPD患者的发病率和死亡率逐年增加，且医疗成本日益升高，目前临床上使用的药物疗效有限，寻找到新的药物迫在眉睫。由于慢性气道炎症在COPD的发生发展中起重要作用，且COPD患者的发病与其体内细胞因子的调控失衡密切相关，利用细胞因子及其受体拮抗剂抑制气道炎症可能是今后COPD防治的趋势和方向。

黄连素是一种从黄连等植物中提取出的异喹啉类生物碱，在亚洲分布较为广泛，在我国作为中草药应用历史悠久，具有广谱抗菌作用，临床上主要用于清热解毒和治疗肠道感染[13]，其价格低廉，无明显不良反应。目前研究还发现黄连素有较强的抗炎和一定的免疫调节作用[4]。黄连素可负向调节炎症细胞因子和炎性介质的释放，例如白介素（ILs）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、前列腺素（PGs）等，其抗炎机制可能与黄连素能抑制炎症过程中的转录因子-κB（NF-κB）活化信号途径有关。Jiang等[14]研究发现，黄连素能抑制LPS诱导的NF-κB信号途径活化和炎性反应进展。本研究结果发现，不同剂量（25、50、100 mg/kg）的中药黄连素均能使COPD大鼠BALF中中性粒细胞数、巨噬细胞数计数及IL-8、IL-17水平明显下降，IL-10水平明显上升。说明黄连素可能通过启动机体的免疫机制，下调炎症因子IL-8、IL-17水平，上调抗炎因子IL-10水平这一途径来抑制气道炎症的发生与发展。本研究还发现随着黄连素干预剂量的增加，COPD大鼠BALF中中性粒细胞数、巨噬细胞数计数及IL-8、IL-17水平下降越明显，IL-10水平上升越明显，呈一定的正向剂量-效应关系。

综上所述，本实验发现不同剂量黄连素均可抑制COPD模型大鼠的气道炎症，其机制可能与黄连素下调炎症因子IL-8、IL-17水平、增强抗炎因子IL-10水平这一途径有关，且此效应与黄连素剂量成一定正相关，提示黄连素可能成为一种治疗COPD的有效且便宜的药物，其抗炎的具体分子机制、所涉及的细胞信号通路尚有待进一步实验研究。

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Effects of Berberine on the airway inflammation of rats with chronic obstructive Pulmonary disease

ZHAO Jun1ZHANG Xilin1HE Limin1CHEN Yuluo1MING Kaihua2

1.Department of Geratology,Guangzhou First Municipal People's Hospital,Guangdong Province,Guangzhou 510180, China;2.Department of Laboratory Medicine,Guangzhou First Municipal People's Hospital,Guangdong Province, Guangzhou 510180,China

Objective To investigate the effects of Berberine on the airway inflammation of rats with chronic obstructive pulmonary disease.Methods Fifty male and healthy Wistar rats were randomly divided into five groups,with 10 rats in each group,including NS control group,COPD group and 25,50,100 mg/kg Berberine group.Chronic obstructive pulmonary disease rats models were established by passive cigarette smoking plus intratracheal instillation of lipopolysaccharide.Bronchoalveolar lavage fluid(BALF)of left lung sample were collected.Polymorphonuclear(PMN)and alveolar macrophage (AM)counts in BALF were measured with Wright-Giemsa staining method.Interleukin-8 (IL-8),interleukin-10(IL-10),interleukin-17(IL-17)were detected with enzyme linked immunosorbent assay.Results The levels of PMN,AM counts and IL-8,IL-17 levels were significantly increased in BALF of COPD model group compared with saline control group(P＜0.01),however,the level of IL-10 was just on the contrary(P＜0.01).After intervention with different doses of Berberine,compared with COPD model group,the levels of PMN,AM counts and IL-8,IL-17 levels were significantly decreased in BALF (P＜0.01),however,the level of IL-10 was increased to varying degrees (P＜0.01),and the higher the dose of Berberine,this effects were more obvious.Conclusion Different doses of Berberine can inhibit the airway inflammation of COPD rat model.The mechanism is associated with Berberine lowered levels of inflammatory cytokine IL-8,IL-17 and enhance the level of anti-inflammatory cytokine IL-10,and this positive effect of Berberine is related to its dose.

Chronic obstructive pulmonary disease;Berberine;Airway inflammation;Interleukin

R563

A

1673-7210（2015）11（a）-0040-04

2015-05-04本文编辑：程 铭）

赵俊（1978.9-），硕士，副主任医师；研究方向：COPD发病机制研究。