侧柏叶对烟草仓储害虫烟草甲和赤拟谷盗的毒杀作用

吴 彦,张文娟,李志华,郑历史,王萍娟,韦建玉,黄东业,田兆福,李小兰,杜树山*

1.广西中烟工业有限责任公司技术中心,南宁市北湖南路28号 530001

2.北京师范大学中药资源保护与利用北京市重点实验室,北京市新街口外大街19号 100875

3.辽宁中医药大学,辽宁省大连市双D港生命一路77号 116600

侧柏叶对烟草仓储害虫烟草甲和赤拟谷盗的毒杀作用

吴 彦1,张文娟2,李志华1,郑历史3,王萍娟1,韦建玉1,黄东业1,田兆福1,李小兰1,杜树山*2

1.广西中烟工业有限责任公司技术中心,南宁市北湖南路28号 530001

2.北京师范大学中药资源保护与利用北京市重点实验室,北京市新街口外大街19号 100875

3.辽宁中医药大学,辽宁省大连市双D港生命一路77号 116600

为有效防治烟草仓储害虫,进行了新型植物防护剂的开发研究.通过熏蒸和触杀试验测试了侧柏叶挥发油及单体成分活性,并通过GC/MS分析了侧柏叶挥发油的化学成分.结果显示:①GC/MS分析共鉴定出侧柏叶挥发油成分34种,占总成分的93.28%,其主要成分为:α-蒎烯(15.08%)、雪松醇(12.63%)、3-蒈烯(9.68%)和石竹烯(9.02%).②通过生物活性筛选,侧柏叶挥发油对烟草甲和赤拟谷盗触杀的半数致死量分别为50.45和48.59µg/头;对二者熏蒸活性的半数致死浓度为145.40和39.25 mg/L.③从侧柏叶挥发油中得到3种活性成分:α-蒎烯、β-水芹烯和4-萜烯醇.因此,侧柏叶挥发油及其活性单体对烟草甲和赤拟谷盗均具有一定的触杀和熏蒸活性.

烟草;仓储害虫;烟草甲;赤拟谷盗;侧柏叶;挥发油;活性

侧柏叶为柏科植物侧柏[Platycaldus orientalis(L.)Franco]的干燥枝叶,主要成分为黄酮类化合物、鞣质和挥发油等[1-2],柏叶挥发油中富含多种具有杀虫活性的化合物.目前关于侧柏叶的研究主要集中在其挥发油化学成分分析以及侧柏叶挥发油对人肺癌细胞[3]、细菌[4]及真菌[5]的抑制作用方面,而对害虫的毒杀作用则鲜见报道.烟叶在贮藏过程中易遭到害虫的侵害[6],其中烟草甲(Lasioderma serricorne Fabricius)为优势种、赤拟谷盗(Tribolium castaneum Herbst)为仅次于优势种的种类.据CORESTA估计,烟草甲虫每年对贮存烟草造成的损失约为1%[7].我国在20世纪90年代曾对全国贮烟害虫的为害程度进行了调查,每年因虫害引起的烟叶质量损失率约为1.64%,其中烟草甲虫为害引起的质量损失远大于其他贮烟害虫[8-9].在烟草仓储常规的害虫防治方面目前以磷化氢(磷化铝)熏蒸最为普遍,但磷化氢(磷化铝)的长期使用会对环境和人类健康造成一定影响[10-11].由此,2010年4月,美国环保署(EPA)发布了农药中磷化铝和磷化镁熏蒸剂的使用限制[12].近年来植物源杀虫剂的研究和开发受到一定重视,其中挥发性植物成分如植物精油是目前研究较多的一类植物杀虫剂,具有高度选择性,易于分解,对人畜安全性高等优点.且多数对天敌生物毒性小,对害虫却有引诱、忌避、拒食和生长调节等作用[13-14].根据柏科植物精油中富含的杀虫活性物质及杀虫特性,选择资源丰富的侧柏叶为靶标,对其挥发油及单体化合物进行杀虫活性试验,旨在开发出新型植物防护剂,有效防治烟仓害虫.

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

柏科植物侧柏Platycladus orientalis(L.)Franco的干燥枝梢和叶购于河北省安国药材市场.侧柏叶样本(BNU-CMH-Dushushan-2012-09-10-010)保存于北京师范大学资源学院北京市重点实验室,新鲜枝叶风干1周后备用.

正己烷、乙醚、无水硫酸钠等均为分析纯(北京北化精细化学品有限责任公司).

Thermo Finngen TRACE DSQ气-质联用仪,质谱检索NIST谱库,GHP-9160隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);移液枪(量程范围0.1～2.5µL、0.5～10µL和10～100µL,大龙创兴实验仪器有限公司);Bruker Avance DRX 500核磁共振谱仪(美国布鲁克公司).

1.2 方法

1.2.1 样品处理与分析

取侧柏叶8 kg粉碎后,用挥发油提取器进行提取,时间为6 h,油水经正己烷溶剂萃取,无水硫酸钠处理后过滤,常压浓缩至不含溶剂,得到无色挥发油13.4 mL并于4℃冰箱保存,侧柏叶出油率为0.17%.

1.2.2 化合物的分离

侧柏叶挥发油10 mL,经正相硅胶柱层析,采用正己烷、正己烷-乙酸乙酯、乙酸乙酯依次梯度洗脱分段,获得25个馏分段,再经石油醚-丙酮(100∶1,体积比)反复硅胶柱层析分离,最终分别从馏分段3、8和16中获得3种单体化合物.

1.2.3 生物活性的筛选

1.2.3.1 熏蒸活性的测定

参照文献[14]的方法测定挥发油及单体化合物对烟草甲和赤拟谷盗的熏蒸活性.将10头供试昆虫(试虫)放入直径2.5 cm,高5.5 cm的玻璃瓶中,然后用移液枪吸取10µL样品的正己烷稀释液(预实验浓度为50%、10%和2%;根据预实验结果设置5个浓度梯度)滴于置瓶盖内直径20 mm的滤纸片上,另取正己烷为空白对照,磷化氢和甲基溴分别作为烟草甲和赤拟谷盗的熏蒸活性阳性对照,挥发20 s后,迅速拧紧瓶盖密封,形成密闭空间,瓶口涂有聚四氟乙烯,防止试虫接触到含药剂的滤纸.每处理重复5次,每重复10头.处理后置于温度(29±1)℃,相对湿度为70%～80%的恒温培养箱中培养24 h,观察记录死亡情况,并计算死亡率与校正死亡率.采用SPSS17.0统计软件分析计算半致死浓度LC50(mg/L).观察死亡情况前先用力摇动玻璃瓶,再将玻璃瓶倒置,5 min后观察,虫体不动即为死亡.

死亡率=(死虫数/试虫数)X100%

校正死亡率=(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)X100%

1.2.3.2 触杀活性的测定

参照文献[15]的方法测定挥发油及其单体化合物对烟草甲和赤拟谷盗的触杀活性.将羽化一周左右的成虫从培养瓶中取出,先用乙醚麻醉,然后用移液枪取0.5µL样品的正己烷稀释液(浓度同1.2.3.1节)滴于试虫的前胸背板上(置于冰袋上操作),处理后放入直径2.5 cm,高5.5 cm玻璃瓶中,正己烷为空白对照组,除虫菊素作为阳性对照组,各样品设置5个浓度,每个浓度重复5次,每个重复试虫10头.处理组、空白对照组及阳性对照组培养温湿度条件、时间和试虫的死亡情况调查与计算同1.2.3.1节,计算半致死剂量LD50(μg/头).

2 结果与分析

2.1 侧柏叶挥发油的化学成分分析

GC/MS总离子流色谱见图1,经计算机检索NIST数据库,比对各峰的MS碎片并结合有关文献谱图解析,鉴定出34种化合物,见表1.其中鉴定出的α-蒎烯含量最高,占挥发油成分的15.08%.

图1 侧柏叶挥发油GC/MS总离子流图

表1 侧柏叶挥发油化学成分及其相对含量

表1(续)

有研究表明,对于侧柏叶,水蒸气蒸馏法提取挥发性成分较完全[4].结合图1和表1可知,侧柏叶挥发油共鉴定出34种化学成分,占总挥发油的93.28%,提取较完全,其中主要成分为α-蒎烯、雪松醇、3-蒈烯、石竹烯和α-石竹烯,化合物类型以烯、醛、醇和酯等为主.

有文献报道,山东济南产侧柏叶挥发油的成分主要为α-蒎烯(24.89%)、β-雪松烯(20.96%)和4-蒈烯(9.16%)[15].辽宁千山产侧柏叶挥发油主要成分为β-雪松醇(31.43%)和2,6-二叔丁基对甲酚(17.46%)[16].新疆产侧柏叶主要成分为α-侧柏烯(17.20%)、α-蒎烯(8.42%)和柠檬烯(4.92%)[17].这与本实验结果存在一定差异.说明同种植物品种由于产地(生态环境)、生长年限和采样时间等不同导致其组成及含量的差异.

2.2 化合物分离

取侧柏叶挥发油10 mL,经过反复硅胶柱层析分离,共得到3种单体化合物,经鉴定分别为α-蒎烯[18](0.98 g)、β-水芹烯[19](0.48 g)和4-萜烯醇[20](0.16 g).

2.3 生物活性

2.3.1 熏蒸活性

由表2可知,侧柏叶挥发油对烟仓害虫烟草甲和赤拟谷盗均有一定的熏蒸毒杀作用,LC50分别为145.40和39.25 mg/L.在分离的3种化合物中,4-萜烯醇对两种烟仓害虫的熏蒸毒性最好,且对烟草甲的熏蒸毒性是赤拟谷盗的2.88倍.然而,4-萜烯醇对烟草甲和赤拟谷盗的熏蒸活性均小于对照药剂磷化氢和甲基溴.在熏蒸活性测试中,β-水芹烯对烟草甲和赤拟谷盗的毒性也较高.从侧柏叶挥发油中得到的3种化合物中,α-蒎烯对两种烟仓害虫的熏蒸活性较弱,其对赤拟谷盗的毒性强于对烟草甲的毒性.侧柏叶挥发油的主要成分α-蒎烯、β-水芹烯和4-萜烯醇对两种烟仓害虫的活性均大于侧柏叶挥发油的活性.

表2侧柏叶挥发油及单体对烟草甲和赤拟谷盗的毒性

2.3.2 触杀活性

与熏蒸活性相比,侧柏叶挥发油的3种单体化合物的触杀活性均较弱,且均低于相同实验条件下的对照(除虫菊素)对烟草甲和赤拟谷盗的触杀活性.侧柏叶挥发油的3种单体化合物中触杀活性最好的是4-萜烯醇,4-萜烯醇对烟草甲和赤拟谷盗触杀的LD50分别为5.42和19.67 mg/L.α-蒎烯对赤拟谷盗的触杀活性是烟草甲的2.9倍.而β-水芹烯对烟草甲的触杀活性高于赤拟谷盗,是赤拟谷盗触杀活性的1.34倍.除了α-蒎烯对烟草甲的触杀活性较弱外,β-水芹烯、4-萜烯醇对两种烟仓害虫的触杀活性均大于侧柏叶挥发油对烟草甲和赤拟谷盗的触杀活性.

3 小结与讨论

通过GC/MS分析及生物活性筛选发现:①侧柏叶挥发油成分主要是单萜和倍半萜;②侧柏叶挥发油及其3种主成分α-蒎烯、β-水芹烯和4-萜烯醇对烟仓害虫烟草甲和赤拟谷盗均有一定的毒性.因此,将侧柏叶挥发油及其活性成分开发为新型植物型熏蒸剂或防护剂并应用于烟草仓储害虫防治具有重要意义.

本试验中测定了侧柏叶挥发油的杀虫活性,发现侧柏叶挥发油及其部分单体化合物对烟仓害虫烟草甲和赤拟谷盗均具有一定的熏蒸和触杀毒性.虽然作用效果低于阳性对照,但作为植物防护剂,具有对有害生物高效、对非靶标生物安全、易分解、分解产物对环境无损害的特点[7,11,13],在仓储害虫防治过程中已成为较理想的化学农药替代品之一.然而,目前有关侧柏叶挥发油对烟仓害虫的驱避作用,对成虫产卵行为的干扰作用、拒食作用以及对害虫种群的抑制作用方面还需进一步深入研究,对烟仓害虫的作用机理仍需要进一步试验.

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责任编辑 董志坚

Toxic Activities ofPlatycladus orientalisAgainstLasioderma serricorneand Tribolium castaneumin Stored Tobacco

WU Yan1,ZHANG Wenjuan2,LI Zhihua1,ZHENG Lishi3,WANG Pingjuan1,WEI Jianyu1,HUANG Dongye1,TIAN Zhaofu1,LI Xiaolan1,and DU Shushan*2

1.Technology Center,China Tobacco Guangxi Industrial Co.,Ltd.,Nanning 530001,China
2.Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese MedicineProtection and Utilization,Beijing Normal University,Beijing 100875,China
3.College of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,Liaoning,China

In order to effectively control the pests in stored tobacco leaves,new botanical protectants were studied and developed.The activities of essential oil and isolated components of Platycladus orientalis were tested via fumigation and contact toxicity assays,and the chemical components in the essential oil were analyzed by GC/MS.The results showed that:1)A total of 34 components were identified in the essential oil,which accounted for 93.28%of total components;and the major components were α-pinene(15.08%),cedrol(12.63%),3-carene(9.68%)and caryophyllene(9.02%).2)By means of bioactivity screening,the essential oil possessed potential contact toxicity against Lasioderma serricorne(LD50=50.45 μg/adult)and Tribolium castaneum(LD50=48.59 μg/adult), and it also possessed fumigation toxicity against Lasioderma serricorne(LC50=145.40 mg/L)and Tribolium castaneum(LC50=39.25 mg/L).3)Three active components,α-pinene,β-phellandrene and 4-terpinenol,were obtained from the essential oil.It was proved that the essential oil of Platycladus orientalis and its active isolated components possessed certain contact and fumigation toxic activities against Lasioderma serricorne and Tribolium castaneum.

Tobacco;Pest in stored tobacco;Lasioderma serricorne;Tribolium castaneum;Platycladus orientalis;Essential oil;Activity

S43

A

1002-0861(2015)10-0031-06

10.16135/j.issn1002-0861.20151005

2014-09-19

2015-07-10

北京市自然科学资金资助项目quot;竹叶花椒防治药材仓储害虫活性物质基础及作用机理研究quot;(7142093).

吴彦(1972-),博士,副研究员,主要从事天然植物在卷烟减害增香中的应用研究及药理学研究.E-mail:abelabel@126.com;*

杜树山,E-mail:dushushan@bnu.edu.cn

吴彦,张文娟,李志华,等.侧柏叶对烟草仓储害虫烟草甲和赤拟谷盗的毒杀作用[J].烟草科技,2015,48(10):31-35,56.WU Yan,ZHANG Wenjuan,LI Zhihua,et al.Toxic activities of Platycladus orientalis against Lasioderma serricorne and Tribolium castaneum in stored tobacco[J].Tobacco Scienceamp;Technology,2015,48(10):31-35,56.