玉米ZmCIPK6基因的克隆及植物表达载体的构建

李横江 黄慧艳 张小菊

摘要：根据MaizeDGB数据库中ZmCIPK6基因序列设计引物，采用RT-PCR技术从玉米中克隆了1个ZmCIPK6基因。ZmCIPK6基因cDNA全长1 739 bp，5′-非编码区长281 bp， 3′-非编码区长111 bp， 编码区长1 347 bp，编码448个氨基酸，预测分子量为48.8 KDa，等电点为9.14。氨基酸同源性分析发现，ZmCIPK6与高粱SbCIPK6同源性较高。根据ZmCIPK6的基因序列和植物表达载体pCAMBIA3301的多克隆位点设计带有限制性内切酶位点的特异性引物，以质粒pMD18-T-ZmCIPK6为模板，PCR扩增ZmCIPK6基因片段，双酶切目的片段及载体，回收后连接，构建成该基因的植物表达载体。经PCR检测及测序鉴定，表明成功构建了ZmCIPK6基因的植物表达载体，为进一步遗传转化研究基因的功能奠定基础。

关键词：玉米；ZmCIPK6基因；植物表达载体

中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）21-5432-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.059

Cloning of ZmCIPK6 Gene and Construction of Its Plant Expression Vector

LI Heng-jiang， HUANG Hui-yan， ZHANG Xiao-ju

（Urban Construction School， Huazhong University of Science and Technology Wuchang Branch， Wuhan 430067， China）

Abstract：According to the sequence of ZmCIPK6 in MaizeDGB database，primers were designed. RT-PCR method was used to clone ZmCIPK6 gene. A gene coding for ZmCIPK6 was isolated from maize （Zea mays）.The full length ZmCIPK6 cDNA was 1 739 bp，including a 281 bp 5′-UTR，an ORF of 1 347 bp，and a 111 bp 3′-UTR.This cDNA sequence encoded a polypepide of 448 amino acid residues with a predicted molecular mass of 48.8 kDa and a basic isoelectric point of 9.14. The deduced amino acid sequence had a high homology with SbCIPK6 from Sorghum bicolor.According to the restriction enzyme sites of expression vector pCAMBIA3301 and sequence of ZmCIPK6 gene，one pair of primers containing restriction enzyme sites were designed. The ZmCIPK6 gene was obtained from pMD18-T-ZmCIPK6 by PCR. PCR product and the plasmid pCAMBIA3301 were digested by the corresponding restricted enzymes respectively，and then the ZmCIPK6 gene was cloned into pCAMBIA3301 vector.PCR and sequencing results suggest that plant expression vector of ZmCIPK6 gene was constructed successfully.

Key words： maize；ZmCIPK6 gene； plant expression vector

玉米是重要的饲料作物，又是食品、化工、燃料、医药等行业的重要原料。中国是仅次于美国的第二大玉米产销国，玉米在中国粮食安全中起着极其重要的作用。干旱、盐碱和极端的温度等外界非生物胁迫对玉米的生长和发育产生负面影响，严重影响玉米的产量和品质。许多转录因子、功能基因和蛋白激酶能够对外界的非生物胁迫产生应答，使植物产生对外界胁迫的抵抗能力[1，2]。在玉米抗逆胁迫中蛋白激酶CIPK具有重要的作用，逆境胁迫诱导CIPKs基因的表达，例如，在拟南芥中异位表达ZmCIPK16增强转基因植物的耐盐能力[3]。ZmCIPK21受干旱、高盐、高温和ABA胁迫诱导表达[4]。ZmCIPK10基因受非生物胁迫诱导表达[5]。ZmCIPK1、ZmCIPK17和ZmCIPK18受干旱和低温胁迫诱导表达[6]。在玉米幼苗叶片中，ZmCIPK1受甘露醇、氯化钠、ABA和低温诱导表达量明显上调，在24 h内保持较高的转录水平[7]。ZmCIPK3受NaCl、ABA、甘露醇和低温的诱导，转录水平在12 h内呈上升趋势[8]。ZmCIPK42基因主要受高盐和高热胁迫诱导表达，中等程度受干旱胁迫诱导表达，不受ABA和低温胁迫诱导[9]。NaCl和ABA诱导3个玉米CIPK基因AY104819，EU974290和EU968441的表达[10]。以上研究表明，这些玉米CIPK基因在植物应答逆境胁迫的信号传导过程中具有重要的作用。本研究利用RT-PCR方法从玉米中克隆了1个ZmCIPK6基因的cDNA并构建了该基因的植物表达载体，为ZmCIPK6基因的遗传转化研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为玉米自交系B73。

1.2 方法

1.2.1 玉米材料处理 种子经0.1% HgCl2消毒，播种于装有营养土的花盆中，在光照培养箱中以28 ℃12 h 光照，22 ℃12 h黑暗条件下培养至三叶期，取玉米叶片，立即经液氮冷冻，-80 ℃保存，供提取总RNA。

1.2.2 RNA提取及cDNA第一链的合成 按照植物RNA提取试剂TRIzol[天根生化科技（北京）有限公司]的操作说明书提取玉米叶片总RNA，总RNA用DNase I （北京全式金生物技术有限公司）处理，去除基因组DNA。按照反转录试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]的操作步骤合成cDNA第一链，产物作为基因克隆的模板。

1.2.3 克隆ZmCIPK6全长cDNA及序列分析 根据ZmCIPK6序列设计引物， CIPK6-F（5′-CCGCGATCCCGTGCTTCCTTCTCGCA-3′）和CIPK6-R（5′-TATCGAATCGAGAACAGTGACGCAATCA-3′），以玉米自交系B73叶片cDNA第一链为模板，使用LA-Taq[宝生物工程（大连）有限公司]扩增基因全长cDNA，按说明书的体系和PCR程序进行扩增。PCR产物亚克隆至pMD18-T[宝生物工程（大连）有限公司]载体，经菌液PCR检测后，阳性克隆送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。利用DNAMAN软件进行多重序列比较和进化树分析。

1.2.4 构建ZmCIPK6的植物表达载体 根据ZmCIPK6基因cDNA序列和pCAMBIA3301的多克隆位点设计1对引物，上游引物添加Nco Ⅰ酶切位点，下游引物添加Bgl Ⅱ酶切位点，引物为CIPK6p-F（5′-GCGCCATGGCCGCGATCCCGTGCTTCCTTCTC-3′）、CIPK6p-R（5′-GGCAGATCTTATCGAATCGAGAACAGTGACGCAA-3′）。获得带有酶切位点的PCR产物，用Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切后亚克隆至植物表达载体pCAMBIA3301，菌液PCR检测是否有片段插入，阳性克隆送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 ZmCIPK6基因的克隆及分析

根据MaizeDGB数据库中的ZmCIPK6序列，从玉米叶片中克隆了1个ZmCIPK6基因。ZmCIPK6全长cDNA长1 739 bp，编码区长1 347 bp，5-非编码（UTR）区长281 bp， 3-UTR长111 bp，编码448个氨基酸（图1）。ZmCIPK6氨基酸序列预测分子量为48.8 KDa，等电点为9.14。1个激酶结构域和1个CIPK家族中保守的NAF调节结构域分别位于ZmCIPK6蛋白的N端区和C端（图2）。

进化树分析发现，ZmCIPK6蛋白质与高粱、谷子、大麦、乌拉图小麦、水稻和二穗短柄草中的CIPK6蛋白质高度同源，一致性达81.4%～93.5%，其中与高粱CIPK6蛋白质的进化关系最近，共同分在一个进化分支（图3）。

2.2 ZmCIPK6基因植物表达载体的构建及鉴定

采用PCR方法获得了带有NcoⅠ和Bgl Ⅱ酶切位点的扩增产物，大小为1 757 bp（图4）。将该产物亚克隆至植物表达载体pCAMBIA3301中，采用菌液PCR的方法对重组质粒pCAMBIA3301-ZmCIPK6进行鉴定，结果表明，能够从转化pCAMBIA3301-ZmCIPK6的大肠杆菌菌液中扩增出大小为1 757 bp的目的片段。测序结果表明，插入的序列与ZmCIPK6序列完全一致，表明成功构建了pCAMBIA3301-ZmCIPK6（图5）。

3 小结

本研究克隆了1个玉米ZmCIPK6基因，通过生物信息学方法预测ZmCIPK6中含有CIPK家族保守的功能域，而且通过同源性和进化树分析发现该基因与其他植物中的CIPK6蛋白质的氨基酸序列具有高度的同源性，说明本研究克隆的ZmCIPK6基因是玉米CIPK家族的1个成员。本研究构建的ZmCIPK6基因植物表达载体，为下一步转化玉米对该基因在逆境胁迫中的功能分析奠定基础。

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