结核杆菌感染T细胞斑点试验和腺苷脱氨酶检测对结核性胸膜炎诊断价值探讨

朱 敏，李 英，马希涛

(河南省人民医院 呼吸与危重症科，郑州450003)

结核性胸膜炎是一种最常见的胸膜疾病，在各种不同病因的胸腔积液中占30% ～60%，也是肺外结核病常见表现形式［1］。该病临床表现多样，仅依据病史、查体、影像学检查、实验室化验资料和疗效观察，很难准确诊断，易误诊和漏诊引起严重后果。诊断的金标准是胸腔积液结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis pleural effusion，MTB)涂片抗酸染色阳性或培养阳性，但阳性率较低，且培养对实验室要求高及培养时间较长;另外有胸膜活检病理学检测阳性，但其具有创伤性，临床应用不普及［2］。近年来结核感染T 细胞斑点试验(T -SPOT.TB)在诊断结核病中的作用越来越受到人们的重视，有研究报道T-SPOT.TB 对诊断结核具有较高的敏感性及特异性，优于常规的检查方法。本研究将胸腔积液T-SPOT.TB 检测和传统的腺苷脱氧酶(adenosine deaminase，ADA)检测作对照，比较其对结核性胸膜炎诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2013年9月—2015年3月在河南省人民医院住院的胸腔积液患者82 名，其中男52 例，女30 例;年龄16 ～82(43.9 ±16.5)岁。剔除诊断不明确及临床资料不完整的10例，余下72 例分为:①结核性胸膜炎组(结核组):38 例，其中男26 例，女12 例，年龄(42.1 ±17.3)岁，均经细菌学或病理学证实。②非结核性胸膜炎组(对照组):34 例，其中男20 例，女14例，年龄(45.8 ±15.6)岁，包括:恶性胸腔积液22 例，类肺炎胸腔积液9 例，肺栓塞1 例，结缔组织病2 例。入选病例排除人免疫缺陷病毒感染，无免疫抑制剂使用史。

1.2 方法 ①T -SPOT.TB 检测:采集肝素抗凝胸腔积液50 mL，于2 h 内用T - SPOT.TB 试剂盒(英国Oxford Immunotech 公司生产)的说明书进行以下步骤:将胸腔积液离心后取沉渣，用淋巴细胞分离液分离胸腔积液单个核细胞，与结核特异性抗原相对分子质量为6 000 的早期分泌抗原靶(early secretory antigenic target - 6，ESAT -6)和相对分子质量为10 000 的培养滤液蛋白(culture filtrate protein 10，CFP -10)在抗γ -干扰素抗体预包被的板中共同孵育，37 ℃放置16 ～20 h。经碱性磷酸酶偶联的二抗和底物显色后用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)对斑点进行计数，并按照说明书的判断标准进行结果判定。空白对照孔内斑点数＜10，且阳性对照孔内斑点数＞20 时视为实验有效。当空白对照孔内斑点数0 ～5 个，任一实验孔斑点数减去空白对照后≥6，结果判为阳性;当空白对照孔内斑点数6 ～10 个，任一实验孔斑点数大于空白对照的2 倍，结果判为阳性。T -SPOT.TB 的实验结果用每106 SEMC 中斑点形成细胞(spot forming cells，SFCs)的数目来描述，即SFCs/106SEMC。当ESAT-6 或CFP -10 有一项阳性，即判定为阳性。根据两组T -SPOT.TB 检测形成的斑点形成细胞(SFC)数建立受试者工作特征曲线(ROC)，根据Youden 指数确定T -SPOT.TB 诊断结核性胸膜炎的最佳临界值。②ADA 测定:应用10 mL 抗凝玻璃管收集胸腔积液10 mL，离心后取上清液利用过氧化物酶法测定ADA，试剂为北京利德曼生化股份有限公司生产，严格按说明书操作。ADA≥45 U/L 判断为阳性。根据两组ADA 检测值建立受试者工作特征曲线(ROC)，根据Youden 指数确定ADA 诊断结核性胸膜炎的最佳临界值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0 统计软件进行统计学分析，正态分布数据用均数±标准差表示;非正态分布数据用中位数(四分位间距)表示，两组间SFC 数比较用Mann Whitney U 检验;两种检测方法的敏感度和特异度比较采用Pearson χ2检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组间不同抗原T -SPOT.TB 形成SFC 数量比较 SFC 数量均呈非正态分布，分别以ESAT-6 和CFP -10 作为抗原，结核组SFC 数量均显著高于对照组，P ＜0.001 差异有统计学意义。见表1。

表1 两组患者胸腔积液中不同抗原T-SPOT.TB形成SFC 数量的比较

2.2 胸腔积液中T -SPOT.TB 检测结果 结核性胸膜炎组38 例中36 例为阳性，非结核性胸膜炎组34 例中3 例阳性。胸腔积液中T - SPOT.TB 在结核性胸膜炎诊断的敏感度为94.7%，特异度为91.2%，Youden 指数为85.9%，阳性预测值为92.3%，阴性预测值为93.9%。见表2。

2.3 胸腔积液中ADA 检测结果 结核性胸膜炎组38 例，平均(46.3 ±7.3 )U/L ，其中30 例为阳性。非结核性胸膜炎组34 例，平均(23.5 ±7.9)U/L ，其中1 例阳性。胸腔积液中ADA 在结核性胸膜炎诊断的敏感度为78.9%，特异度为97.0%，Youden指数为76.0%，阳性预测值为96.8%，阴性预测值为80.5%。见表3。

表2 两组患者胸腔积液中T—SPOT.TB 检测结果比较

表3 两组患者胸腔积液ADA 检测结果比较

2.4 胸腔积液中T-SPOT.TB 与ADA 检测的诊断效能 T-SPOT.TB 检测结核性胸膜炎的敏感度与ADA 比较，差异有统计学意义(χ2= 4.145，P =0.042)，T-SPOT.TB 检测结核性胸膜炎的敏感特异度与ADA 比较，差异无统计学意义(P =0.614)。T-SPOT.TB 检测用于诊断结核性胸膜炎的ROC曲线下面积为0.930，95%可信区间0.86 ～0.99，当Youden 指数达到最大时，确定T-SPOT.TB 诊断结核性胸膜炎最佳临界值为38 SFCs/106SEMC，此时诊断的敏感度为95.3%，特异度为98.7%。ADA检测用于诊断结核性胸膜炎的ROC 曲线下面积为0.973，95%可信区间0.79 ～0.97，当Youden 指数达到最大时，确定ADA 诊断结核性胸膜炎最佳临界值为32.5U/L，此时诊断的敏感度为94.7%，特异度为88.2%。

3 讨论

结核性胸膜炎是由淋巴细胞介导为主，多种细胞及细胞因子参与的综合病理性免疫反应。当机体感染MTB，无论是潜伏感染还是活动性结核病，均可产生致敏淋巴细胞，当应用外源性特异性抗原刺激外周血单个核细胞后迅速产生效应T 细胞，分泌γ-干扰素。ELISPOT 是近年来发展的敏感性最好的检测抗原特异性T 淋巴细胞的技术之一。T -SPOT.TB 应用ELISPOT 技术检测经ESAT -6 及CFP-10 抗原刺激后分泌γ-干扰素的特异性T 细胞数量来诊断结核感染的方法。由于ESAT -6 及CFP-10 这两种蛋白由MTB 的RD1 基因序列合成，而该基因序列仅存在于致病性MTB 之中，卡介苗和环境中的非典型分枝杆菌不含有该基因，故将ESAT-6 及CFP -10 这两种抗原作为刺激物来进行试验，保证了T -SPOT.TB 的高度特异性［3］。但由于外周血T-SPOT.TB 检测不能区分潜伏感染还是活动性结核病，使诊断的特异性受到限制。然而，MTB 感染局部具有隔室化效应，感染部位的致敏T淋巴细胞增多，并显著高于外周血。因此胸腔积液的致敏T 淋巴细胞可能受潜伏感染的机会较外周血低。在结核低流行的英国，Wilkinson KA 等首次研究［4］证实了胸水ELISPOT 检测到分泌γ-干扰素的致敏T 淋巴细胞的可行性。而我国协和医院张丽帆教授于2014年报道［5］胸腔积液分泌γ -干扰素的致敏T 淋巴细胞是外周血4.6 倍，以56SFCs/106 SEMC 为界能够将诊断结核性胸膜炎的敏感性及特异性均提高30%。近期另一项研究结果显示，胸腔积液T-SPOT.TB 检测的敏感度和特异度可以达到95.7% 和100%，显著高于ADA(55.5% 和86.3%)［6］。与本研究诊断的胸腔积液T - SPOT.TB 诊断界值相似。

ADA 是核酸分解代谢酶类，广泛存在于人体各组织中，胸腺、脾和其他淋巴组织中含量较高，红细胞和T 淋巴细胞内ADA 含量最丰富。当发生结核性胸膜炎时，宿主启动细胞免疫，胸膜的淋巴细胞明显增多，活性增强，故ADA 在胸腔积液中含量明显增高［7］。但在一些细菌感染和风湿性疾病引起的胸腔积液中ADA 活性也有所升高，诊断的特异度降低。尉艳霞等研究表明，ADA 诊断结核性胸膜炎最佳临界值为28.7U/L，其诊断的敏感度为75.5%，特异度为95.2%［8］。而与本研究32.5U/L 相比，本研究诊断敏感度升高至94.7%，特异度略低。

综上所述，对于结核性胸膜炎，胸腔积液T -SPOT.TB 具有较好的敏感度，优于传统的胸腔积液ADA 检测，但特异度与ADA 相似。如果胸腔积液TSPOT.TB 联合ADA 同时检测，虽然敏感性下降，但特异度进一步升高，可以有效避免误诊。T -SPOT.TB 能否作为准确诊断结核性胸膜炎的检测手段，还需大规模的临床试验证实。

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