萝卜硫素预处理对大鼠心肌缺血再灌注保护作用的研究

王 策

(南阳医学高等专科学校 基础医学部，河南 南阳473000)

心肌缺血再灌注损伤是临床心血管科常见病理现象，常发生于溶栓治疗、冠状动脉介入治疗、冠状动脉支架植入、冠状动脉搭桥术等疾病过程中。心肌缺血再灌注发生后会产生缺氧复氧再损伤。萝卜硫素(Sulforaphane)，又称“莱菔硫烷”，在西兰花、芥蓝、北方圆红萝卜等十字花科植物中含量较丰富，是常见的抗氧化剂。现代药理研究表明萝卜硫素具有良好的抗氧化、抗肿瘤作用［1］。曲震理［2］报道了萝卜硫素具有良好的抗体外培养心肌细胞凋亡的作用。关于萝卜硫素对在体大鼠心肌缺血再灌注氧化损伤的影响，国内外文献少见报道。本研究通过建立大鼠心肌缺血再灌注模型，以心肌酶学、心肌细胞凋亡及凋亡基因表达为观察指标，研究萝卜硫素对心肌缺血再灌注损伤的影响，以期为心肌缺血再灌注损伤干预开辟新的途径。

1 材料和方法

1.1 实验动物 27 只SDF 级雄性SD 大鼠购自河南省动物试验中心，6 ～7 周龄，重量0.225 ～0.260 kg，证书编号SCXC(豫)2012 -0003。

1.2 药物和试剂 萝卜硫素(购自上海百士凯科技公司，纯度＞95%);TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(绿色荧光)、抗荧光淬灭封片液(购自北京中杉科技有限公司);Bcl-2、Bax 试剂盒(购自大连宝生物工程有限公司)等。

1.3 实验仪器 BL -420E + 生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司);OLYMPUS 荧光显微镜(日本OLYMPUS 公司);7020 全自动生化分析仪(日本日立公司)等。

1.4 实验分组及造模 27 只SD 大鼠以普通饲料分笼喂养，适应性喂养3 d 后，随机分为假手术组、对照组、萝卜硫素组，每组9 只。在冠状动脉左室支结扎前2 h，萝卜硫素组自尾静脉注射萝卜硫素(5 mg/kg)，假手术组和对照组术前2 h 自尾静脉注射等量生理盐水。参照文献方法制作大鼠心肌缺血再灌注模型［3］。称重，以5%水合氯醛(200 mg/kg)进行腹腔麻醉后仰卧位固定于小动物解剖台上，常规气管插管及开胸，完全暴露心脏，以5 -0 号手术线结扎冠状动脉左室支，结扎后心肌颜色先变白而后变紫绀提示结扎成功。假手术组冠状动脉左室支只穿线不结扎，其余2 组行缺血再灌注。结扎20 min后松解结扎线，再灌注1 h。再灌注1 h 后采血并处死大鼠，迅速取出心脏。血液以3 000 r/min 离心10 min 取血清，分离血清用于检测LDH、CK-MB、SOD活性及MDA 含量;同时取部分心肌组织常规固定、包埋和制片，用于检测心肌细胞凋亡和Bcl -2、Bax表达。

1.5 检测指标 ①心肌抗氧化指标检测 用7020全自动生化分析仪检测LDH、CK-MB、SOD 活性及MDA 含量。②心肌凋亡细胞检测 操作步骤按照TUNEL 试剂盒说明书进行，DAB 显色，用荧光显微镜观察:未凋亡心肌细胞发出蓝色荧光，凋亡心肌细胞核发出绿色荧光。在200 倍视野下，随机选择缺血区5 个无重叠视野，计数阳性凋亡细胞，计算心肌细胞凋亡指数(AI)，AI =阳性凋亡细胞/总细胞数×100%。③心肌组织Bcl-2、Bax 表达检测 按照Bcl-2、Bax 试剂盒说明书进行。

1.6 统计学方法 测量数据用SPSS 13.0 软件包处理，计量资料用均数±标准差(x ±s)表示，采用t检验，P ＜0.05 表示有显著性差异。

2 结果

2.1 抗氧化指标检测 与假手术组比较，对照组大鼠血清LDH、CK-MB 及MDA 含量显著升高，SOD活性显著降低，差异有统计学意义(P ＜0.05);相比对照组，萝卜硫素干预可以显著降低血清中LDH、CK-MB 活性及MDA 含量(P ＜0.05)，显著升高血清中SOD 活性(P ＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清抗氧化指标及心肌凋亡指数比较(n=9， ±s)

表1 各组大鼠血清抗氧化指标及心肌凋亡指数比较(n=9， ±s)

注:与假手术组比，1)P ＜0.05;与对照组比，2)P ＜0.05。

组别 SOD(U/mL) LDH(U/mL) CK-MB(U/mL) MDA(c/nmol·mL -1)AI/%假手术组 146.35 ±7.16 2.15 ±1.02 0.76 ±0.28 2.26 ±0.82 2.35 ±0.96对照组 87.21 ±3.861) 7.71 ±1.261) 6.28 ±1.191) 4.81 ±0.151) 20.05 ±1.161)萝卜硫素组 118.19 ±6.612) 5.38 ±1.172) 2.27 ±1.212) 3.15 ±1.082) 15.76 ±2.152)

2.2 心肌细胞凋亡检测 心肌组织切片经荧光染色处理后，在荧光显微镜下可看到正常心肌细胞核呈蓝色荧光，着色浅而均匀;凋亡细胞核固缩，或碎为不规则状，呈现绿色明亮的强荧光反应。见图1。假手术组可见有少量散在的绿色荧光染色细胞核，对照组绿色荧光染色细胞数量明显增多，萝卜硫素干预组绿色荧光染色细胞较对照组明显减少，提示大鼠经萝卜硫素干预后心肌凋亡细胞明显减少。与假手术组比较，对照组大鼠凋亡指数显著升高，差异有统计学意义(P ＜0.05);与对照组比，萝卜硫素干预组凋亡指数显著降低，差异有统计学意义(P ＜0.05)，见表1。

图1 各组大鼠心肌细胞凋亡荧光染色结果×200 白色箭头所示为凋亡细胞。

2.3 心肌Bcl -2、Bax 表达检测 与假手术组比，对照组Bcl-2 表达下降，Bax 表达上升，Bcl-2/Bax比值下降，差异有统计学意义(P ＜0.05);与对照组比较，萝卜硫素干预组Bcl -2 表达上升，Bax 表达下降，Bcl -2/Bax 比值上升，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2

表2 各组大鼠心肌凋亡蛋白Bcl-2、Bax mRNA表达比较(n=9， ±s)

表2 各组大鼠心肌凋亡蛋白Bcl-2、Bax mRNA表达比较(n=9， ±s)

注:与假手术组比，1)P ＜0.05;与对照组比，2)P ＜0.05。

组别Bcl-2mRNA BaxmRNA Bcl-2/Bax假手术组1.58 ±0.02 0.45 ±0.03 3.41 ±0.02对照组 0.69 ±0.051) 0.93 ±0.051) 0.67 ±0.061)萝卜硫素组 0.87 ±0.022) 0.76 ±0.032) 1.21 ±0.042)

3 讨论

缺血再灌注损伤的发生机制尚未清楚。国内外许多学者［4-5］认为再灌注损伤伴随出现炎症反应，由于细胞浸润，释放炎症因子，最终导致血管的内皮细胞损伤，并伴随钙超载等。心肌发生缺血再灌注损伤时，氧自由基和内源性氧自由基清除酶之间失去平衡，前者大量出现，攻击细胞，引发脂质超氧化反应，导致细胞损伤，随之使MDA 释放，血清含量增加，因此MDA 含量可以体现超氧化反应的程度，也是对细胞受损程度的一种间接体现。该研究显示，对照组血清MDA 含量明显增加(P ＜0.05)，说明再灌注导致细胞损伤。同时萝卜硫素干预组血清MDA、LDH 及CK - MB 活性 均 显 著降 低(P ＜0.05)，血清中SOD 活性显著升高(P ＜0.05)，提示萝卜硫素预处理具有明显的抗脂质氧化作用。

缺血再灌注后心肌损伤主要表现形式是细胞凋亡。该实验结果显示，萝卜硫素组可降低心肌细胞凋亡指数(P ＜0.05)，上调凋亡基因Bcl -2 的表达，降低Bax 的表达，使Bcl-2/Bax 比值上升，提示萝卜硫素提前干预对缺血再灌注所致大鼠心肌细胞凋亡具有保护作用，与伊雪［6］等的结果一致。

综上所述，萝卜硫素能通过抗脂质过氧作用减少心肌细胞凋亡，对心肌缺血再灌注损伤产生保护作用。

［1］Dandawate P，Padhye S，Ahmad A，et al.Novel strategies targeting cancer stem cells through phytochemical and their analogs［J］.Drug Deliv Transl Res，2013，3(2):165 -182.

［2］曲震理.萝卜硫素对阿霉素所致体外培养心肌细胞凋亡的影响［J］.社区医学杂志，2014，12(2):47 -48.

［3］Yang J，Chen L，Yang J，et al.MicroRNA-22 targeting CBP protects against myocardial ischemia-reperfusion injury through anti-apoptosis in rats［J］.Mol Biol Rep，2014，41(1):555-561.

［4］Skovsted GF，Kruse LS，Larsen R，et al.Heart ischaemia-reperfusion induces local up-regulation of vasoconstrictor endothelin ETB receptors in ratcoronary arteries downstream of occlusion［J］.Br J Pharmacol，2014，171(11):2726 -2738.

［5］Song X，Chen A，Liu Y，et al.Carvacrol pretreatment attenuates myocardial oxidative stress and apoptosis following myocardial ischemia-reperfusion in mice［J］.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2013，33(11):1624 -1627.

［6］伊 雪，王 帅，邬鹏宇，等.莱菔硫烷预处理对大鼠移植心脏冷缺血再灌注损伤的影响［J］.实用医学杂志，2013，29(23):3850 -3852.