分散固相萃取-高效液相色谱法测定小麦中啶氧菌酯

谢飞飞,黄晓东,卢 健,张 飞

(安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000)

分散固相萃取-高效液相色谱法测定小麦中啶氧菌酯

谢飞飞,黄晓东∗,卢 健,张 飞

(安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000)

建立分散固相萃取-高效液相色谱法测定小麦中啶氧菌酯残留的方法.应用分散固相萃取处理小麦样品,离心得到的上清液过滤膜后,用HPLC-DAD进行检测.采用岛津wondasil C18-WR(5μm,250 mm× 4.6 mm)色谱柱,柱温30℃,乙腈-水(65∶35,V/V)为流动相,流速1.0 m L/min.啶氧菌酯在0.05～1.0 mg/L范围内呈良好线性关系(R＝0.999 9),变异系数为3.34%,平均回收率为89.32%.实验方法操作快速简便、重复性好,适用于小麦中啶氧菌酯的定量检测与分析.

高效液相色谱;分散固相萃取;啶氧菌酯;小麦

啶氧菌酯(picoxystrobin)是一种新型甲氧基丙烯酸酯类抗菌剂,具有杀菌活性强且持久性好的特点,对小麦的叶枯病、网斑病和云纹病具有很强的治愈性[1-4].然而,这类低毒杀菌剂在使用若干年后产生抗药性,成为影响人们身体健康的安全隐患.目前,加拿大、欧盟、新西兰等国均规定了啶氧菌酯在小麦中的最大残留限量,分别为0.06 ppm、0.05 ppm、0.01 ppm,而我国却未做规定.由此看来,未来啶氧菌酯可能成为国外限制我国小麦出口的新一轮技术壁垒,故研究啶氧菌酯残留的检测方法具有现实意义.

目前报道的啶氧菌酯的检测方法主要有气相色谱法[5]、高效液相色谱法[6-8]、气-质联用法、液-质联用法[9-10]、流体化学发光注射法[11],这些方法主要针对水果、水样和白酒中残留的啶氧菌酯的分析[12],对小麦中啶氧菌酯的检测未见报道.以上方法可靠,但步骤繁琐.使用分散固相萃取-高效液相色谱法对小麦中啶氧菌酯的含量进行定量分析,简化了样品的处理步骤,节约了有机试剂用量,同时也减少了对操作人员的伤害,从而为控制小麦中啶氧菌酯残留水平、实现小麦安全生产、保护消费者健康以及制定小麦中啶氧菌酯最大残留限量提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦,产自安徽芜湖;啶氧菌酯标样(纯度≥99%,德国Dr.Ehrenstorfer);N-丙基-乙二胺(PSA)、C18、C8(济南博纳生物技术有限公司);柠檬酸二钠1.5水合物(分析纯,Aladdin-阿拉丁试剂上海有限公司);乙腈(色谱纯,国药集团化学试剂有限公司);氯化钠、无水硫酸镁、无水乙酸钠、乙酸、柠檬酸钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);水为二次蒸馏水.

1.2 仪器和设备

Prominence LC-20A高效液相色谱仪(配有DAD二极管阵列检测器)(日本岛津公司);TD5Z台式低速离心机(湖南凯达科学仪器有限公司);TDZ4-WS低速台式离心机(湖南湘仪集团);FW100高速万能粉粹机(天津市泰斯特仪器有限公司);美国Labnet VX-200旋涡混合仪.

1.3 实验方法

(1)液相色谱条件.岛津wondasil C18-WR色谱柱(5μm,250 mm×4.6 mm);柱温:30℃;检测器:二极管阵列检测器(DAD);流速:1.0 m L/min;进样量:10μL;流动相:乙腈:水＝65∶35;检测波长:245 nm.

(2)标准曲线的绘制.外标法定量,准确称取5.0 mg啶氧菌酯标样,用乙腈配制成1.0 mg/m L的啶氧菌酯标准储备液(不用时置于－18℃以下冰箱避光储存),再用乙腈配制成0.01 mg/m L的啶氧菌酯中间储备液(不用时置于0～4℃冰箱避光储存).用乙腈逐级稀释成质量浓度分别为1.0μg/m L、0.5μg/m L、0.2μg/m L、0.1μg/m L、0.05μg/m L的啶氧菌酯标准溶液,在选定色谱条件下进行HPLC-DAD检测,并计算啶氧菌酯标准曲线线性关系方程.

(3)样品处理.将小麦粉碎后,充分混匀.称取4.0 g小麦样品于50 m L离心管中,加入10 m L水,充分混匀后加入5 m L 1%乙酸酸化的乙腈溶液,0.5 g NaOAc,2.0 g MgSO4,蜗旋振荡5 min使充分混合,转速3 500 r/min离心5 min,取上层清液2 m L于10 m L的离心管中,加入100 mg PSA,300 mg无水硫酸镁,蜗旋振荡5 min,转速4 000 r/min离心5 min,静置,取上层清液,过0.45μm滤膜,供HPLC-DAD分析.

(4)分散固相萃取条件的选择.

①分散吸附剂种类的选择.在小麦粉样品中添加了质量浓度为1.0 mg/kg的啶氧菌酯标准液后,分别用PSA、C18、C8、PSA和C18、PSA和C8、C18和C8这6种组合方式作为分散吸附剂,在其他条件完全相同的情况下,按照上述1.3(3)进行样品处理,供HPLC分析,计算回收率,确定分散吸附剂的种类.

②分散吸附剂加入量的选择.在确定了最佳分散基质萃取剂种类后,考察不同用量对回收率的影响.在加标水平为1.0 mg/kg的小麦粉样品中,分别加入60 mg、80 mg、100 mg、120 mg的分散吸附剂,按上述1.3(3)步骤处理样品,分析计算啶氧菌酯的回收率,确定最佳用量.

③样品加入量的选择.准确称取小麦粉样品3.0 g、3.5 g、4.0 g、4.5 g、5.0 g,啶氧菌酯标准液添加质量浓度为1.0 mg/kg,按上述1.3(3)进行样品处理,HPLC分析后,以回收率的高低作为选定最佳样品加入量的标准.

④加水量的选择.把水加入到匀质后的小麦粉样品中,以加大样品分散程度.在加标水平为1.0 mg/kg的小麦粉样品中,分别加入6 m L、8 m L、10 m L、12 m L、14 m L的水,按上述1.3(3)进行样品处理,通过HPLC分析计算其回收率,确定最优加水量.

⑤方法的重复性实验.在选定的最佳实验条件下对加标水平为1.0 mg/kg的小麦粉样品进行处理及测定,连续5天每天测1次,计算其精密度.

⑥方法的回收率实验.在小麦样品中添加啶氧菌酯标准液,添加水平分别为0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg,在选定的最佳实验条件下分析,平行测定5次,计算相应的添加回收率和变异系数.

⑦结果计算公式.啶氧菌酯质量含量c1(μg/g)按下式计算:

式中,c1为样品中啶氧菌酯含量,μg/g;c为仪器检测的质量浓度,mg/L;V为最终定容体积,m L;m为样品质量,g.

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的选择

(1)分散吸附剂种类的选择.用液相色谱法定量分析食品中的农药残留时,由于基质复杂,如果样品提取后不经净化处理,共流出物会影响目标离子,从而降低检测器的灵敏度.为了消除干扰,对比研究了不同种类的分散吸附剂及其不同组合方式的净化效果,结果如图1所示.由图1可知,两种分散剂同时添加时对小麦粉中啶氧菌酯的回收率没有起到改善的效果,可能是因为两种分散吸附剂同时吸附杂质时,造成了啶氧菌酯的损失.而使用一种分散剂时啶氧菌酯的回收率相对较高,其中,采用PSA做分散吸附剂时啶氧菌酯的回收率最高,故选择PSA为分散吸附剂.

(2)分散吸附剂用量的优化.对比了不同用量分散剂对净化效果的影响,结果如图2所示.由图2可知,在萃取净化过程中PSA的用量对小麦粉中啶氧菌酯的回收率有明显影响,加入120 mg PSA作用时,样品色谱图中出现的杂峰较多,并且部分干扰与样品峰重叠,峰形差,回收率偏低,推测可能是由于PSA在去除基质干扰的同时对目标物也有一定的吸附.其余的回收率R的高低顺序表现为:R100 mg PSA＞ R80 mg PSA＞R60 mg PSA,最后选定100 mg PSA作为最优添加量,基质干扰较小,回收率较高.

(3)样品加入量的优化.比较了加入不等量样品处理后的啶氧菌酯的回收率如图3所示.由图3可知,加入3.0 g、3.5 g、5.0 g样品时,啶氧菌酯的回收率较低,可能是因为样品与水混合后混合液的分散程度过小或者过大,影响了分散吸附剂对杂质的吸附过程,啶氧菌酯的回收率低;而加入样品4.0 g和4.5 g时,啶氧菌酯都能很好地回收,加样4.0 g时的回收率稍大于加样4.5 g的,故选择最优添加样品量为4.0 g.

(4)加水量的优化.通过加水改变样品颗粒的分散程度,从而对目标物的回收产生了一定的影响如图4所示.由图4可知,净化过程中加水量的多少对啶氧菌酯的回收率影响很大.加水量为6 m L、8 m L和12 m L时目标物的回收率偏小,这可能是因为样品的分散程度太小或太大,影响了净化吸附过程;加水量在10～12 m L范围内小麦中啶氧菌酯的回收率较高,加10 m L水时回收率稍大于加12 m L水处理的样品.故选择前处理过程中加10 m L水浸润样品.

2.2 啶氧菌酯标准曲线的绘制

以峰面积为横坐标,啶氧菌酯的质量浓度为纵坐标,在0.05～1.0 mg/L质量浓度范围内绘制标准曲线,经计算其线性回归方程为:Y＝3.06×10－5X－1.50×10－3,R2＝0.9999,表明0.05～1.0 mg/L质量浓度范围内,色谱峰面积与啶氧菌酯的质量浓度呈良好的线性关系,可以满足定量分析的要求.当信噪比＝3时,算得小麦中啶氧菌酯的最小检出限为0.018 mg/L.质量浓度为1.0 mg/L的啶氧菌酯标准液的色谱图如图5所示.由图5可知,其理论塔板数为4 421,柱效较好,啶氧菌酯的保留时间为11.37 min.

2.3 方法的重复性实验

取小麦粉样品,按上述1.3(4)⑤方法进行测定,结果如表1所示.由表1可知,该方法具有良好的重复性和精密度.

2.4 方法的回收率实验

方法的回收率实验结果如表2所示.由表2可知,啶氧菌酯在小麦中的添加回收率范围为86.52%～91.23%,平均回收率为89.05%,变异系数范围为3.22%～6.19%.小麦粉中啶氧菌酯添加水平为1.0 mg/L时的添加回收色谱图如图6所示.

表1 方法的重复性实验结果

表2 方法的回收率实验结果

2.5 小麦样品的测定

准确称取小麦样品在选定最佳实验条件下进行检测,结果未检出.

3 结论

基质分散固相萃取-高效液相色谱法测定小麦中的啶氧菌酯,在样品前处理操作中进行了优化,快速简便,方法重现性较好.加标回收率在86.52%～91.23%之间,重复性实验RSD为3.34%,最低检出限为0.018 mg/L,说明测量仪器系统性能好、灵敏度高、重现性好、且检测限低,已达到农药残留分析技术的要求.在实际小麦样品检测中未检出啶氧菌酯,未来可用于小麦中啶氧菌酯的监测.

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Determination of picoxystrobin in wheat by modified QuEchERS-HPLC

XIE Fei-fei,HUANG Xiao-dong∗,LU Jian,ZHANG Fei
(College of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

A modified QuEch ERS-HPLC method was established for quantitative determination of picoxystrobin wheat.The sample preparation was completed for the extraction and clean-up steps with the modified QuEchERS method,then it was centrifugated and filtered before detection by HPLC-DAD.The mobile phase was a 65∶35(by vol)mixture of acetonitrile and water,the flow rate was 1.0 m L/min,and a wondasil C18-WR column(5μm,250 mm×4.6 mm)was used with column temperature of 30℃.Good linearity of picoxystrobin was obtained over the range of 0.05～1.0 mg/L (R＝0.999 9),the variation coefficient was 3.34%,and the average recovery was 89.32%.The method was an ideal analysis method with the advantages of convenience,fast speed and good repeatability, which can be used for the quantitative detection and analysis of picoxystrobin in wheat.

HPLC;Qu Ech ERS;picoxystrobin;wheat

TS206

A

1672-2477(2015)05-0008-05

2015-09-11

谢飞飞(1989-),女,安徽淮北人,硕士研究生.

黄晓东(1963-),男,安徽芜湖人,副教授,硕导.