乙型肝炎病毒核酸实时荧光定量 PCR检测在临床诊断中的价值

魏留柱 （内蒙古自治区巴彦淖尔市临河市人民医院免疫科，内蒙古 临河051000）

乙型肝炎病毒核酸实时荧光定量 PCR检测在临床诊断中的价值

魏留柱 （内蒙古自治区巴彦淖尔市临河市人民医院免疫科，内蒙古 临河051000）

目的：探讨实时荧光定量 PCR（FQ-PCR）检测乙型肝炎病毒 DNA在临床诊断中的价值．方法：对我院收治的190例乙型肝炎病毒感染患者的血清提取 DNA，采用实时荧光定量PCR检测血清中HBV-DNA，ELISA法测定 HBV血清标记物．结果：FQ-PCR检测的灵敏度和重复性良好，111例HBeAg（＋）／HBeAb（－）标本中FQ-PCR均呈阳性，HBV-DNA拷贝数1．04×107／mL，67例HBeAg（－）／HBeAb（＋）标本中，阳性率为58．2%，12例HBeAg（－）／HBeAb（－）标本中，阳性率为33．3%．结论：实时荧光定量 PCR可以实现准确定量检测HBV-DNA，可使诊断更准确，治疗更合理．

乙型肝炎病毒；荧光定量 PCR；免疫测定

0 引言

乙型肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的肝脏炎性病变，可引起多器官损害．该病是一类严重威胁人类健康的世界性传染疾病，属于散发性疾病，一年四季均可发病，近年来发病趋势一直上升［1］．实时荧光定量 PCR实现了 PCR从定性到定量的飞跃，是检测乙肝病毒血症最敏感的方法，与常规 PCR相比，具有特异性更强、自动化程度高等特点，目前已广泛应用于临床疾病诊断［2］．本文对 190例乙型肝炎病毒核酸采用实时荧光定量 PCR法检测，并与乙肝病毒标志不同模式进行对比，结果如下．

1 资料和方法

1．1 一般资料 选取我院 2013-06／2014-03传染病科接诊的 190例乙型肝炎病毒感染患者血清提取DNA，其中男123例，女67例，平均年龄34±5岁．

1．2 试剂与方法 采用 ELISA法检测 HBV免疫标志物，匹基盒由上海信裕科技有限公司提供，严格按照匹基盒说明书操作，采用酶标仪进行结果判断［3］．

采用实时荧光定量PCR法检测HBV-DNA，严格按照匹基盒说明书进行操作，按照常规方法提取患者血清 HBV-DNA．具体操作为：取待测血清样本和匹基盒中对照品各100 μL，10 000 r／min离心10 min；取上清液，加入100 μL DNA提取液 I，震荡摇匀后，10 000 r／min离心10 min；弃上清，沉淀物中再加入25 μL DNA提取液 II，震荡混匀，沸水浴 10 min，10 000 r／min离心10 min，取上清液备用［4］．取37．6 μL PCR反应液加入0．2 mL离心管中，再加 0．4 μL Taq酶及0．06 μL尿苷酶作为反应管，加入 2 mL处理样本和对照品，设置对照品浓度梯度为 108，107，106，105，104，103copies／mL．

混匀后转移至检测区，采用核酸扩增仪进行PCR扩增，条件为：93℃预变性 2 s，94℃预变性 5 s，60℃预变性30 s，共40个循环，引物和探针由上海生工生物工程公司合成（表 1）［5］．

1．3 统计学处理 采用 STATA7．0统计分析软件直线相关和回归分析，对样本数据进行χ2检验，P＜0．05为差异具有显著性．

2 结果

2．1 PCR的灵敏度和重复性 将对照品 10倍稀释，用实时荧光定量PCR测定，结果见图1，以对数浓度为横坐标，循环次数为纵坐标，具有良好的线性关系．将系列稀释的对照品用荧光定量 PCR测定10次，每管重复3次，重复性结果见表2，表明PCR重复性良好．

表1 PCR所用引物和探针

图1 HBV DNA的FQ-PCR标准曲线

表2 FQ-PCR的批内和批间重复性

2．2 FQ-PCR检测血清 HBV-DNA结果 血清HBV-DNA与 HBV标记物 FQ-PCR检测的结果见表3．

表3 HBV-DNA与HBV标记物FQ-PCR检测结果

3 讨论

临床研究发现，急慢性肝炎的主要致病因子是乙型肝炎病毒（HBV），该病毒是一种 DNA病毒，对人和猩猩有易感性，引发乙型病毒性肝炎疾病．我国有2亿人感染乙型肝炎病毒，且每年都呈增长趋势，临床资料显示部分乙肝患者能够形成持久免疫力，清除体内乙肝病毒，形成慢性感染患者，大多患者逐步演化为肝硬化，甚至肝癌．目前临床诊断 HBV感染最敏感的方法是 PCR技术，能够准确反映感染情况，缩短感染后的窗口期，PCR扩增技术能够准确检测一些血清学指标阴性的突变株DNA［6］．本文研究结果表明，实时荧光定量PCR技术检测HBV-DNA具有较高的灵敏性和良好的重复性．ELISA方法检测 HBV血清是诊断 HBV感染的标志性方法，具有高灵敏性和准确性，可以间接反映 HBV的表达和复制，临床检验经验发现，血清HBeAg阳性是HBV复制活跃、传染性强的标志．本文研究结果表明，HBeAg阳性患者血清HBV-DNA阳性率及含量显著高于其它患者（P＜0．005），HBeAg（＋）系统与HBeAg（－）系统比较，差异有显著（P＜0．005）．综上所述，ELISA法结合FQ-PCR技术能够准确研究 HBV感染的自然进程，监测患者对抗病毒治疗的反应，对 HBV感染的诊断、疗效判定等有重要的指导意义．

［1］韩俊英，曾瑞萍．荧光定量 PCR技术及其应用［J］．国外医学：遗传学分册，2000，23（3）：117－120．

［2］蔡叶琴，孙 彦，黄 黎．血清HBV－DNA与HBV免疫学标志物之间的相关性研究［J］．河北医学，2011，17（2）：153－155．

［3］黄四爽，熊 勤．乙型肝炎病毒核酸实时荧光定量 PCR检测在临床诊断中的价值［J］．数理医药学杂志，2012，25（4）：484－485．

［4］陈素玲，胡国龄，谭德明．381例HBV感染者 HBV DNA前 C区基因突变的研究［J］．中国现代医学杂志，2001，11（8）：48－50．

［5］Pas SD，Fries E，De Man RA，et al．Development of a quantitative real-time detection assay for hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays［J］．J Clin Microbiol，2000，38（8）：2897－2901．

［6］周 丹．乙型肝炎病毒DNA实时荧光定量PCR检测在临床诊断中的价值［J］．检验医学与临床，2010，7（20）：2271－2272．

The value of real-time fluorescence quantitative PCR in clinical diagnosis of HBV DNA

WEI Liu-Zhu
Department of Immunology，Linhe People's Hospital，Linhe 051000，China

AIM：To explore the value of the real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（FQ-PCR）in clinical detecting heptitis B virus（HBV）DNA．METHODS：The sera from 190 patients were measured by FQ-PCR，and the plasma markers were detected by ELISA．RESULTS：The detection sensitivity and reproducibility of FQ-PCR are excellent．There were 111 patients that the FQ-PCR results of HBeAg（＋）／HBe-Ab（－）samples were positive，with 1．04×107／mL of HBVDNA copy on the average．In the 67 patients'HBeAg（－）／HBe-Ab（＋）samples，the positive rate was 58．2%．In the 12 patients'HBeAg（－）／HBeAb（－）samples，the positive rate was 33．3%．CONCLUSION：FQ-PCR can ensure the accurate and quantitative HBV-DNA detection，accurate diagnosis and reasonable treatment．

HBV；fluorescence quantitative PCR；immunoassay

R512．6＋2

A

2095-6894（2015）01-134-02

2014-11-18；接受日期：2014-12-04

魏留柱．大专，主管检验师．研究方向：临床检验．Tel：0478-8295982 E-mail：weifanchengw@163．com