miR-320-3p调控脂肪细胞分化的研究

王昌兰，高志红，常爱玲，王宝利

miR-320-3p调控脂肪细胞分化的研究

王昌兰1，2，高志红2，常爱玲1，2，王宝利1△

目的探讨miR-320-3p对脂肪细胞分化的影响。方法分离并培养小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），并对其进行脂肪细胞诱导分化3 d，用qRT-PCR检测miR-320-3p在成脂分化过程中的表达水平。在骨髓基质细胞系ST2中转染miR-320-3p，对其进行成脂方向诱导分化，用油红O染色和qRT-PCR检测miR-320-3p对ST2成脂分化的影响。结果MSCs向脂肪细胞分化过程中miR-320-3p表达增加（P＜0.01）；与转染阴性对照NC mimics相比，ST2细胞转染miR-320-3p mimics后油红O染色显示脂肪细胞明显增多，脂肪细胞特异性转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）和脂肪细胞脂肪酸结合蛋白4（FABP4）基因表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论miR-320-3p可促进ST2向脂肪细胞分化。

脂细胞；间质干细胞；细胞分化；成脂分化；微RNAs；miR-320-3p

microRNA（miRNA）是一类高度保守、非编码的RNA，约由22个核苷酸组成，主要通过与靶基因3′-非翻译区（UTR）结合，抑制蛋白的翻译水平。许多研究表明miRNA在间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）及前脂肪细胞向脂肪细胞分化过程中起到重要调节作用［1］。而miR-320-3p与脂肪细胞分化关系的研究鲜见文献报道。本研究测定了MSCs向脂肪细胞分化时miR-320-3p的表达水平，

探讨miR-320-3p对脂肪细胞分化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料小鼠ST2细胞由本实验室保存；转染试剂Lipofectamine RNAimax为Invitrogen公司产品；miR-320-3p mimics及其阴性对照片段NC mimics为上海吉玛生物科技公司产品；miRNA提取试剂盒及总RNA提取试剂盒均购自OMEGA公司；miRNA cDNA第一链合成试剂盒及miRNA特异性引物购自Gene Copoeia公司；诱导试剂胰岛素、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤购自Sigma公司；吲哚美辛为Cyagen公司产品。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的分离培养及分组通过全骨髓贴壁培养法分离小鼠骨髓间充质干细胞，用含10%胎牛血清的α-MEM培养基于37℃、5%CO2培养箱内培养，待细胞融合度在80%以上时传代。在实验前24 h将MSCs接种于12孔板中，分为分化组与对照组，待细胞融合度达100%时对分化组进行成脂分化诱导3 d，对照组采用溶媒处理。诱导试剂包含0.05 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、5 mg/L胰岛素、0.05 mmol/L吲哚美辛和0.05 μmol/L地塞米松。

1.2.2 qRT-PCR检测miR-320-3p表达水平将MSCs成脂诱导3 d后回收细胞，按照OMEGA miRNA kit说明书分别提取细胞miRNA并采用miRNA cDNA第一链合成试剂盒逆转录为cDNA。用SYBR Green qPCR试剂分别进行miR-320-3p和U6（内参）的qRT-PCR扩增，上游引物：miR-320-3p-F 5′-CAAAAGCTGGGTTGAGAGGG-3′；U6-F 5′-TTCGTGAAGCGTTCCATATT-3′，下游引物为试剂盒自带。PCR反应总体积为20 μL，反应体系为3 μL cDNA，上、下游引物终浓度为400 nmol/L，SYBR Green qPCR mix 10 μL，用去离子水补充至20 μL体系。反应条件为：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸15 s，进行40个循环。采用2-ΔΔCt法计算分化组目的基因相对于对照组的表达量，CT值指每个反应管内的荧光信号到达一定阈值时所经历的循环数；样品△CT=目的基因CT值–U6 CT值，所有实验重复3次以上。

1.2.3 ST2细胞的转染及分组用含5%胎牛血清的α-MEM培养基于37℃、5%CO2培养箱内培养，实验前将ST2细胞接种于12孔板中，按照Lipofectamine RNAimax转染试剂说明书，分别转染miR-320-3p mimics、NC mimics。转染20 h后更换新鲜α-MEM完全培养基，诱导方法同1.2.1。

1.2.4 油红O染色观察miR-320-3p mimics转染组与NC mimics转染组脂肪细胞分化情况待脂滴成熟后弃细胞培养基，PBS洗2次；4%多聚甲醛固定20 min；弃去固定液，加入PBS洗1次，弃液；加入60%异丙醇，室温放置1～2 min，弃液；加入60%油红O染液，染色5 min，蒸馏水漂洗干净，于倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.5 qRT-PCR检测脂肪细胞转录因子和表征基因的表达水平miR-320-3p mimics及其对照NC mimics转染ST2细胞后，于成脂诱导后48 h收获细胞，按照OMEGA总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，采用Gene Copoeia逆转录试剂盒进行逆转录。qRT-PCR检测脂肪细胞特异性转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）及表征基因脂肪细胞脂肪酸结合蛋白4（FABP4）相对于β-actin（内参）的表达量，引物序列如下：β-actin上游5′-AAGACCTCTATGCCAACACAG-3′，下游5′-GGAGGAGCAATGATCTTGATC-3′；C/EBPα上游5′-CTGATTCTTGCCAAACTGAG-3′，下游5′-GAGGAAGCTAAGACCCACTAC-3′；FABP4上游5′-AAATCACCGCAGA CGACAGG-3′，下游5′-GGCTCATGCCCTTTCATAAAC-3′；PPARγ上游5′-CTTGACAGGAAAGACAACGG-3′，下游5′-GCTTCTACGGATCGAAACTG-3′。PCR反应总体积为20 μL，反应体系为3 μL的cDNA，特异性上、下游引物终浓度为400 nmol/L，SYBR Green qPCR mix 10 μL，用去离子水补足20 μL体系。反应条件及计算方法同1.2.2，所有实验重复3次。

1.3 统计学方法采用SPSS 16.0软件进行统计处理。计量资料数据以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSCs成脂诱导后miR-320-3p表达MSCs细胞在成脂诱导后miR-320-3p的表达明显增加，其表达量在分化组（3.70±0.26）较对照组（1.00±0.15）增加2.7倍，差异有统计学意义（t=15.430，P＜0.01）。

2.2 miR-320-3p对脂肪细胞分化的影响ST2细胞转染miR-320-3p mimics及NC mimics后，经油红O染色，miR-320-3p转染组较NC mimics转染组细胞脂滴明显增多，分化更加成熟，见图1。

Fig.1The effect of miR-320-3p on adipogenic differentiation in ST2 cell shown by oil red O staining图1 miR-320-3p对ST2成脂分化的影响（油红O染色，×200）

2.3 qRT-PCR检测miR-320-3p mimics对脂肪特异性基因表达的影响ST2细胞转染miR-320-3p mimics后，成脂特异性基因FABP4、PPARγ以及C/EBPα mRNA明显增多，分别为NC mimics转染组的3.33、4.01及5.10倍，差异有统计学意义，见表1。

Tab.1The effect of miR-320-3p on transcription levels of FABP4，PPARγ and C/EBPα mRNA表1 miR-320-3p mimics对FABP4、PPARγ和C/EBPα mRNA的影响（n=3）

Tab.1The effect of miR-320-3p on transcription levels of FABP4，PPARγ and C/EBPα mRNA表1 miR-320-3p mimics对FABP4、PPARγ和C/EBPα mRNA的影响（n=3）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

C / E B P α 1 . 0 0 ± 0 . 0 9 5 . 1 0 ± 0 . 7 4 9 . 9 5 6＊＊组别N C m i m i c s转染组m i R -3 2 0 -3 p m i m i c s转染组t F A B P 4 1 . 0 0 ± 0 . 1 9 3 . 3 3 ± 0 . 8 2 4 . 1 9 5＊P P A R γ 1 . 0 0 ± 0 . 3 0 4 . 0 1 ± 0 . 3 2 1 0 . 9 5 2＊＊

3 讨论

骨髓来源的MSCs是一类具有自我更新与多向分化潜能的干细胞，能通过比较简单的技术从骨髓中分离和纯化，体外扩增多代仍保持其干细胞的分化潜能。骨髓来源的MSCs可以在不同的诱导条件下分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞、神经细胞和心肌细胞等［1-2］。miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，参与转录后翻译的调节，在细胞分化、增殖和凋亡中发挥重要调节作用。2003年Xu等［3］发现miR-14敲减后的果蝇三酰甘油和二酰甘油的水平增高，自此开始了miRNA调节脂肪细胞分化的研究。对于miR-320-3p，研究发现其在神经系统疾病及心脏缺血再灌注中具有重要作用［4-6］。近年来Ling等［7］证实miR-320的反义寡核苷酸可以改善有胰岛素抵抗的3T3-L1细胞对胰岛素的敏感性，但miR-320-3p对脂肪细胞分化的调控鲜有研究。

本研究中，在MSCs向脂肪细胞分化过程中miR-320-3p升高2.7倍，提示miR-320-3p对MSCs的成脂分化可能具有调节作用。进一步研究发现，在ST2细胞中转染miR-320-3p后脂肪细胞分化增多，脂肪细胞特异性转录因子PPARγ和C/EBPα及成脂表征基因FABP4的表达都较对照组有明显升高，证实miR-320-3p能促进脂肪细胞分化。

miRNA可通过与某些脂肪细胞调节基因的3′-UTR结合而抑制其表达，进而调节脂肪细胞的分化。如miR-223通过靶向抑制成纤维细胞生长因子受体2（fibroblast growth factor receptor 2，Fgfr2）的表达促进脂肪细胞分化［8］；miR-17-92通过与视网膜母细胞瘤相关蛋白p130（retinoblastoma-like protein p130，Rb2/p130）的3′-UTR结合抑制Rb/p130的翻译，促进前脂肪细胞分化成熟［9］；miR-194通过靶向减少鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ（chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factorⅡ，COUP-TFⅡ）的表达抑制脂肪细胞的分化［10］；miR-139-5p则靶向抑制Notch和胰岛素受体底物1（IRS1）而抑制脂肪细胞分化［11］。然而，关于miR-320-3p诱导脂肪细胞分化的机制还不清楚。

脂肪细胞分化及其调控失常与人类多种疾病如肥胖症、糖尿病、脂肪肝、高脂血症及骨质疏松等密切相关［12］。新近有研究发现再生障碍性贫血的发病也可能与异常免疫诱导骨髓间充质干细胞的过度脂肪化有关［13］。因而研究miRNA对脂肪细胞分化的调控作用及其机制可能对此类疾病的防治有重要指导意义，可为疾病治疗提供新的靶点。

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（2015-05-21收稿 2015-08-05修回）

（本文编辑 李国琪）

The impact of miR-320-3p on adipocyte differentiation

WANG Changlan1，2，GAO Zhihong2，CHANG Ailing1，2，WANG Baoli1△
1 Key Laboratory of Hormones and Development（Ministry of Health），Metabolic Diseases Hospital&Institute of Endocrinology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Department of Endocrinology，General Hospital of Tianjin Medical University△

ObjectiveTo study the role of miR-320-3p in adipocyte differentiation.MethodsMarrow mesenchymal stem cells were isolated from mice and cultured then induced with adipogenic agents for 3 days.The transcription level of miR-320-3p was examined by qRT-PCR.Stromal ST2 cells were transfected with miR-320-3p，followed by adipogenic treatment.Oil-red O staining and qRT-PCR were employed to assess the differentiation of adipocytes induced by miR-320-3p.ResultsThe expression level of miR-320-3p increased in MSCs after adipogenic treatment（P＜0.01）.Addition of miR-320-3p in ST2 cells promoted the formation of oil-red O positive adipocytes and up-regulated the expression levels of adipogenic transcription factors such as peroxisome proliferator-activated receptor γ（PPARγ），CCAAT/enhancer binding protein-α（C/EBPα）and the marker gene adipocyte fatty acid binding protein 4（FABP4），compared to cells that transfected with miR-320-3p mimics（P＜0.05）.ConclusionmiR-320-3p promotes ST2 cells differentiation into adipocytes.

adipocytes；mesenchymal stem cells；cell differentiation；adipogenesis；microRNAs；miR-320-3p

R34

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.003

国家自然科学基金资助项目（81271977，81472040）

1天津医科大学代谢病医院内分泌研究所，卫生部激素与发育重点实验室（邮编300070）；2天津医科大学总医院内分泌科

王昌兰（1987），女，硕士，主要从事基因分子生物学研究

△通讯作者E-mail：bliwang72@163.com