首发精神分裂症患者血清标记物32 kD蛋白检测及质谱分析☆

许瑞环 万星 袁文斌 梁静文 罗艺 李康 廖长征 徐文莉 叶昌斌 朱磊 齐立国

为寻找诊断精神分裂症的生物学指标，国内外学者多年来进行了各方面的努力[1-6]，但至今未取得实质性的成果。刘辉等[7-8]在对精神分裂症病理机制的研究中，发现患者血清循环免疫复合物中存在一条特异性较强的32 kD蛋白带，为精神分裂症的临床研究提示了一个新的方向，但并未引起广泛关注，也缺乏继续深入的研究报告。本研究将在既往研究基础上对32 kD蛋白条带进行质谱分析，以期发现精神分裂症的特异性血清标志物。

1 对象与方法

1.1 研究对象 患者组来自于深圳市康宁医院2011年11月至2012年6月的初诊患者。入选标准：①符合《国际疾病与相关健康问题统计分类》（International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems，ICD-10）精神分裂症诊断标准；②首次发病；③阳性和阴性症状量表（positive and negative syndrome scale，PANSS）总分≥60分；④未接受过抗精神病药物治疗。排除标准：①脑器质性或躯体疾病所致的精神障碍者；②合并各种躯体疾病者，如心、肝、肾、内分泌、神经系统等疾病；③精神活性物质或药物滥用者。共收集60例患者，男38例，女22例，年龄18～52岁，平均（31.30±9.89）岁。

对照组为深圳市龙岗中心医院的健康体检者。入选标准：①无神经精神类疾病或病史；②未使用过精神类药物。排除标准同患者组。共收集58名对照，其中男30名，女28名，年龄21～55岁，平均（35.98±8.52）岁。

1.2 研究方法

1.2.1 血清标本制备 用真空采血管采集受试者清晨空腹静脉血3 mL，30 min内放于4℃冰箱中静置1 h，待析出血清后置4℃下3000 r/min离心5 min，吸取血清分装，-80℃冻存备用。

1.2.2 循环免疫复合物分离分析 应用7%聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）蛋白沉淀法[9]获取免疫复合物：取100 μL血清加入0.5 mL EP管内，再混入 100 μL的 7%PEG6000G 溶液过夜；4℃下1500 r/min离心20 min，去上清，管底沉淀即为循环免疫复合物；加入50 μL去离子水，与沉淀物充分漩涡混合后备用。

按照《分子克隆实验指南》的方法步骤[10]，对上述混合物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electro⁃phoresis，SDS-PAGE），分离胶选择10%，走胶完成后分析电泳图。参照蛋白marker确认32 kD蛋白条带，并计数该条带在患者组和对照组的阳性率。将32 kD条带取适当范围小心切下，-80℃保存，集中进行质谱分析。

1.2.3 32 kD蛋白条带的成分分析 质谱分析由华大科技有限公司完成。由于质谱分析的对象通常是小分子肽段，因此先使用胰蛋白酶将蛋白酶解，形成小肽段，并将酶解后产生的肽段冻干，然后与不同浓度的甲酸（FA）和乙腈（ACN）基质混合，并点样至质谱点样板，在岛津公司LC-20AD型号纳升液相色谱仪中，通过一级质谱和二级质谱进行分离，并进行分子量测定。最后，使用Mascot 2.3.02软件，将串联质谱数据与SwissProt/UniProt数据库模拟得到的理论质谱数据进行匹配，从而得到蛋白质覆盖率和蛋白种类结果，并进行基因本体（gene ontology，GO）、蛋白相邻类的聚簇（clus⁃ter of orthologous groups of proteins，COG）、京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路等功能注释。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0进行统计分析。患者组和对照组32 kD蛋白阳性率比较采用χ2检验，检验水准α为0.05。

2 结果

2.1 差异蛋白条带及其阳性率 图1显示部分受试者血清循环免疫复合物混合液的SDS-PAGE凝胶电泳图，患者组电泳图比对照组在25～35 kD之间多了一个蛋白条带，该条带分子量约为32 kD。患者组中38例发现32 kD蛋白条带，阳性率为63.33%，对照组均未发现该蛋白条带，两组差异具有统计学意义（χ2=54.182，P＜0.001）。

2.2 质谱分析情況 对酶解的肽段进行质谱分析，共鉴定出228种蛋白，根据肽段覆盖蛋白的比率获得蛋白序列的覆盖率如图2所示。其中27种蛋白（12%）的序列覆盖率为40%～70%，13种蛋白（6%）的覆盖率为35%～40%，24种蛋白（11%）的覆盖率为30%～35%，19种蛋白（8%）的覆盖率为25%～30%。

利用质谱分析法，从32 kD（30～35 kD之间）条带中鉴定出14种蛋白，各蛋白在38例32 kD蛋白条带阳性患者中的出现频率见表1。其中载脂蛋白A-1、聚集因子、补体因子H、cDNA编码的未知蛋白1和2出现频率较高（频率均≥47%），其余蛋白的出现频率较低（频率均＜47%）。其中发现 3种互补 DNA（complementary DNA，cDNA）编码的未知蛋白分别与补体C4-B、β-2糖蛋白、红细胞膜蛋白带7蛋白高度相似，其参数如表2所示。

3 讨论

本研究是前期研究[7-8]的继续，32 kD蛋白条带是本研究的目标物，所以获取循环免疫复合物采用温和、稳定的PEG沉淀法，分离分析免疫复合物选择广泛应用的SDS-PAGE凝胶电泳法。结果表明精神分裂症患者组32 kD蛋白阳性率为63.33%，对照组未检出，与刘辉等[7-8]的研究结果基本一致。

表1 质谱分析鉴定的14种蛋白及其在32kD条带阳性者中频率

表2 3种cDNA编码未知蛋白的参数

质谱分析显示在32 kD蛋白条带中，载脂蛋白A-1、纤胶凝蛋白同种型、补体因子H和聚集因子出现频率较高，3种未知的cDNA编码高度相关蛋白分别与补体C4-B、β-2糖蛋白、红细胞膜蛋白带7蛋白高度相似。关于载脂蛋白A-1在精神分裂症患者中变化的研究结果并不一致。Martins等[11]发现载脂蛋白A-1在精神分裂症患者脑脊液中有所上调，然而另一些学者发现在精神分裂症患者其他组织样本中，例如血清、红细胞、肝脏，甚至是脑脊液中，载脂蛋白A-1却是下调的[12-14]。多种载脂蛋白与精神类疾病相关，表明二者可能存在联系[15-16]。关于纤胶凝蛋白（collagen fibrinogen do⁃main containing,FCN）与疾病关联性的研究多集中于FCN1、FCN2和FCN3基因[17-18]，此外更多的是关于纤凝蛋白在微生物识别方面的研究[19]。然而目前并没有研究发现这种蛋白与精神类疾病有直接关联。补体系统在精神分裂症中的研究仍在探索中。Julian等[20]认为血浆补体因子H（complement factor H，CFH）的磷酸化作用在精神分裂症患者用药后降低。本研究提示首发精神分裂患者血清中CFH表达异常，至于在用药前后其血清含量的变化还有待于进一步探讨。

在32 kD条带中检测到3种未知蛋白分别与补体C4-B、β-2糖蛋白和红细胞膜蛋白带7蛋白的氨基酸序列高度相似。因为质谱技术的局限性，本研究只是通过对某些特异的多肽链进行检测，得到与其相应的蛋白质序列。另外，首发精神分裂症疾病的分类和病程是否对32 kD蛋白的检出有影响，本研究没有考虑。这些不足之处有待以后进一步完善。下一步计划对已知蛋白进行定量分析，对未知蛋白进行功能分析，从而进一步准确地揭示这一条异常蛋白条带形成的原因及其对临床诊断和治疗的价值。

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