健康和感染黄龙病沙糖桔嫩梢挥发性成分的分析

杨玉枝，徐 迪，岑伊静

(华南农业大学昆虫生态研究室，广州510642)

柑桔黄龙病 (huanglongbing，HLB)是柑桔属的一种毁灭性病害 (Aubert，1987;Teixeira et al.，2005;Bové，2006)，感病植株表现出叶片斑驳型、均匀黄化型、缺素型黄化和红鼻子果等症状，最终失去结果能力。黄龙病给全世界柑桔生产带来严重威胁。亚洲柑桔木虱Diaphorina citri Kuwayama也称柑桔木虱，是黄龙病亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus和美洲种 Candidatus Liberibacter americus主要的媒介昆虫，在我国主要分布于广东、广西、福建、台湾、浙江、云南、四川、江西、海南、湖南、贵州等长江流域以南的11个省区 (杜丹超等，2011)，寄主植物为柑桔、橙、柚、柠檬、酸橙、九里香、黄皮等芸香科植物，是柑桔类新梢期的主要害虫，以成、若虫吸食汁液为害为主，引起嫩梢干枯、萎缩、新叶扭曲畸形，若虫排泄出白色分泌物蜜露能引起柑桔煤烟病，影响光合作用 (黄邦侃，1953;Tsai et al.，2000)。

植物次生物质在植食性昆虫寄主植物选择过程中起着化学信号作用，可能影响昆虫的取食、发育和产卵等行为 (戴建青等，2010)。Nadarasah等 (2011)研究表明，在长期的进化过程中，植物的病原菌通过媒介昆虫传播，病原菌－媒介昆虫－寄主植物三者间的相互作用是一个复杂的生物过程，植物病原菌的特异性致病因子能够在特定的寄主植物上寄生并造成危害，也有可能使昆虫成为它们的选择性寄主。柑桔黄龙病的田间传播和流行与柑桔木虱的带菌及其活动有十分密切的关系，柑桔木虱若虫在感染黄龙病及健康寄主上的水平位置转移过程中若虫更趋向黄龙病植株(吴丰年等，2013)。可以推测，与健康柑桔相比，黄龙病柑桔挥发物含有对柑桔木虱具有吸引作用的关键物质或关键物质含量的变化，为此本文采用顶空固相微萃取和气质联用 (GC/MS)分析了健康沙糖桔和黄龙病沙糖桔嫩梢挥发物的成分，为更有效地综合利用信息化合物进行预测预报和调控柑桔木虱行为提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试植物

健康沙糖桔 Citrus reticulate Blanco.cv.Shatangju:广东省博罗县柑桔研究所苗圃培育的3年生无病苗，在防虫网室内隔离种植，通过Nested－PCR检测确定不携带黄龙病亚洲种病原菌。

黄龙病沙糖桔:从华南农业大学黄龙病研究室繁育的沙糖桔黄龙病盆栽苗上采集病芽，嫁接到健康沙糖桔上使其感染黄龙病。一年后病苗表现典型黄龙病症状并通过Nested－PCR检测呈黄龙病亚洲种阳性。

1.2 实验仪器

QCD－1500型大气采样仪，中国盐城银河科技有限公司;DVB/CAR/PDMS 50/30 um萃取头，美国 Supelco公司;GCMS－QP2010气相色谱－气质联用仪，日本 Shimadzu公司;Teflon采样袋(30 cm×26 cm)，大连海得科技有限公司。

1.3 顶空固相微萃取健康和黄龙病沙糖桔嫩梢挥发物

用Teflon(30 cm×26 cm)采样袋套住供试沙糖桔树苗树冠，用橡皮筋将袋口捆扎在树干上，密封至不漏气。用大气采样仪把采样袋里的气体抽干 (约15 min)，然后向采样袋里充入通过活性炭和蒸馏水过滤的空气待充气量达到约采样袋容量的2/3时 (约12 min)，关停大气采样仪用并止水夹掐住采样袋的硅胶管以密封。静置平衡24 h后，把固相微萃取装置的针头插入采样袋内萃取气味，顶空萃取45 min。

1.4 健康和黄龙病沙糖桔嫩叶挥发物的GC-MS分析

将萃取头插入GC/MS进样口，250℃热脱附样品5 min进色谱柱分析。条件参照 (万珊等，2010)并稍作修改，GC:色谱柱为HP－5毛细管柱 (30 m×0.25 mm×0.25 um)，载气为高纯氦气，载气流速为1 mL/min，无分流进样。进样口温度:250℃，起始色谱温度 45℃保持 3 min，3℃/min梯度上升至135℃，并保持2 min，然后8℃/min升到250℃，再保持5 min。MS:EI检测器，接口温度280℃，离子源温度230℃，离子能70 ev，扫描质量范围40－500 amu/s，对采集得到的质谱图与标准谱库进行核对并分析。

2 结果与分析

2.1 健康和黄龙病沙糖桔挥发性化合物分析

采集的挥发性物质经GC－MS的总离子流色谱检测分析鉴定，健康沙糖桔和黄龙病沙糖桔嫩梢挥发性成分均含有烯烃类、醇类、醛类、酯类等物质 (表1)。其中健康沙糖桔的挥发性化学物质主要含有14种，含量从高到低依次为β－榄香烯(17.0%)、β－罗 勒 烯 (15.22%)、β－水 芹 烯(14.29%)、芳樟醇 (10.3%)、Z－石竹烯 (7.07%)、甘香烯 (5.63%)、α－萜品烯 (5.26%)、大根香叶烯(3.82%)、α－石竹烯 (3.53%)、月桂烯 (3.52%)、α－法尼烯 (3.3%)、α－松油醇 (1.81%)、α－甜橙醛(1.19%)、D－柠檬烯 (1.02%);感病沙糖桔中挥发性化学物质主要有13种，含量从高到低依次为β－水芹烯 (59.98%)、β－榄香烯 (9.04%)、α－蒎烯(6.23%)、3－侧柏烯 (3.21%)、柠檬烯 (3.07%)、芳樟醇 (2.39%)、γ－榄香烯 (2.11%)、Z－石竹烯(1.70%)、2－蒈烯 (1.61%)、γ－萜品烯 (1.57%)、月桂烯 (1.13%)、β－松油醇 (1.12%)、β－罗勒烯(0.94%)。

2.2 健康沙糖桔和黄龙病沙糖桔挥发物相同组分化合物的含量变化

健康沙糖桔和感染黄龙病沙糖桔都释放的相同化合物中，有些成分的含量差异比较明显，在感染黄龙病沙糖中，月桂烯、β－罗勒烯、芳樟醇、α－松油醇、β－榄香烯、2－石竹烯、α－石竹烯、大根香叶烯、α－法尼烯、D－荜澄茄烯、β－桉叶醇等物质含量明显低于健康的，而3－侧柏烯、a－蒎烯、β－水芹烯、a－水芹烯、γ－萜品烯、β－松油醇、4－萜烯醇、2－蒈烯等物质的含量则明显高于健康的。

2.3 健康沙糖桔和黄龙病沙糖桔嫩梢挥发物化学组分的差异

健康沙糖桔和感染黄龙病沙糖桔释放挥发性化学物质组分差异较大，其中α－萜品烯、D－柠檬烯、(3E)－罗勒烯、甘香烯、(－)－马兜铃烯 、雅榄蓝烯、α－榄香醇、大根香叶烯B、D－4－大香叶烯醇、石竹烯氧化物、表蓝桉醇、匙叶桉油烯醇、α－甜橙醛仅存在于健康沙糖桔嫩梢中，而柠檬烯、反式－α－香柠檬烯、γ－榄香烯、香橙烯、(+)－表－双环倍半水芹烯、β－芹子烯仅存在于感染黄龙病沙糖桔嫩梢中。

表1 健康和感染黄龙病的沙糖桔嫩梢挥发物主要成分及相对含量Table 1 Components and contents of the volatiles from young shoots of HLB-infected and non-infected citrus

续上表

续上表

3 结论与讨论

本文利用顶空固相微萃取方法提取分析了健康和黄龙病沙糖桔嫩梢挥发物的成分，结果显示健康柑桔嫩梢挥发物的主要组分为β－榄香烯(17.0%)、β－罗 勒 烯 (15.22%)、β－水 芹 烯(14.29%)，黄龙病柑桔嫩梢挥发物的主要组分为β－水芹烯 (59.98%)、β－榄香烯 (9.04%)。Westbrook等 (2011)在田间调查了柑桔木虱对健康柑桔类寄主植物和芸香科寄主植物嫩叶的趋性，发现调料九里香Bergera koenigii L.最能吸引柑桔木虱成虫。Robbins等 (2012)用顶空动态收集调料九里香的挥发物，发现 β－水芹烯含量最高，达48.3%，这与本文利用固相微萃取黄龙病沙糖桔挥发物收集到的最高含量β－水芹烯 (59.98%)的结果相似。β－水芹烯对柑桔木虱的吸引作用值得进一步研究。

健康和黄龙病沙糖桔嫩梢释放的挥发性化学物质种类差异较大，相同组分化合物的含量差异比较明显，这有可能是病原菌与寄主植物接触后，特别是真菌及细菌性病原会释放出如糖蛋白、多糖类、脂肪酸和胜肽等类物质，诱导寄主植物产生防御机制，从而改变寄主植物的挥发性物质、次级代谢产物以及营养组分 (Blua et al.，1992)。病原体可以诱导它们的寄主产生某些物质，具有引诱媒介昆虫的物质来增加植物、昆虫和病原菌间相互作用 (Mayer et al.，2008a，2008b)。植物的保护机制可以通过产生信息化学物质或有毒物质来抵御再次取食，或间接产生某些化学物质来吸引天敌 (Kessler and Baldwin，2001;Kost and Heil，2006;Stout et al.，2006)。植物感病后，病原菌可以诱导宿主植物释放某些有利于他们生长、传播或抑制植物的防御作用的化学物质。Mayer等(2008a)报道，苹果感染病原菌“Candidatus phytoplasma mali”后会引起苹果释放更多的β－石竹烯 (β－caryophyllene)，这种化学物质能引诱媒介昆虫苹果木虱Cacopsylla picta，从而促进病原菌的传播。Mann等 (2012)研究表明柑桔感染黄龙病菌后能诱导植物释放一种特殊的化学物质——水杨酸甲酯，吸引柑桔木虱趋向被感染的植株，但是柑桔木虱最终会回到健康植株并且长期生存，有可能是因为带病植株上的营养物质无法满足木虱的生长发育。寄主感染植物性病原菌对其媒介昆虫的行为造成影响，促进其种群扩散，促进了黄龙病病原菌的传播。揭示寄主植物吸引柑桔木虱的机制将为有效地综合利用信息化合物进行预测预报和调控柑桔木虱行为提供依据。

致谢:在研究过程中得到华南农业大学昆虫生态研究室硕士研究生曾丽霞、乌天宇及本科生罗孝竹等同学无私的帮助和支持，在此表示衷心的感谢。

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