双重荧光实时定量PCR法检测TNF-α mRNA表达水平

姚 霜，郑 璐，于 洋，喻妙梅，潘丽莉，张 俊，冯悦华，罗光华

（苏州大学附属第三医院综合实验室，江苏常州213003）

双重荧光实时定量PCR法检测TNF-α mRNA表达水平

姚 霜，郑 璐，于 洋，喻妙梅，潘丽莉，张 俊，冯悦华，罗光华

（苏州大学附属第三医院综合实验室，江苏常州213003）

目的：建立单管检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和内参GAPDH mRNA表达水平的双重荧光实时定量PCR方法。方法：脂多糖刺激小鼠巨噬细胞Ana-1后提取细胞RNA，经反转录合成cDNA，应用自行设计的不同荧光标记的TNF-α和GAPDH引物探针，经PCR扩增后，在FAM通道和CY5通道分别读取Ct值，同时应用基因测序技术对结果进行验证，并构建质粒标准品分析该方法的灵敏度和重复性。结果：双重荧光实时定量PCR法检测TNF-α的灵敏度达4×101拷贝/μL，检测线性范围可达6个数量级，批内和批间重复性好。结论：新方法消除了目的基因与内参的加样误差，节约成本，快速准确，适用于TNF-α mRNA的定量检测。

双重荧光定量PCR；肿瘤坏死因子-α；GAPDH

巨噬细胞是机体重要的免疫细胞和炎性细胞，经致炎因素刺激后能够产生炎症因子，调控炎症反应［1］。脂多糖是革兰阴性菌细胞壁的重要成分，是诱导机体产生炎症反应的关键物质，通过脂多糖刺激巨噬细胞产生促炎因子建立体外炎症模型，常用于某些潜在抗炎因子（如载脂蛋白M等）或药物作用机制的研究［2］。炎症模型建立的成功与否主要通过细胞产生的肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor a1pha，TNF-α），白细胞介素-1β（inter1eukin-1 beta，IL-1β）等炎症因子的变化水平来衡量，因此，不断探索和改进这些炎症因子mRNA表达水平的PCR检测方法十分必要。本实验以TNF-α为例，以双重荧光实时定量PCR方法代替传统的单重荧光PCR，消除了多管反应体系造成的加样误差，操作简便，准确快捷，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠巨噬细胞株Ana-1购于中国科学院上海细胞库。脂多糖（Sigma公司）。RNA提取试剂盒购于上海博彩生物科技公司，反转录试剂盒（TheroFish公司），PCR热启动酶及其反应体系（Bio1ine公司），LightCyc1er荧光定量PCR仪（Roche公司）。

1.2 体外炎症模型的建立

1×106个/mL的Ana-1细胞铺6孔板，3 h后加入10 μg/mL的脂多糖，6 h后提取细胞RNA。

1.3 细胞RNA的提取及反转录

按照RNA提取试剂盒和反转录试剂盒说明书进行操作。

1.4 引物及探针的设计和合成

根据NCBI数据库中小鼠TNF-α和GAPDH的基因序列，应用Primer Premier 5.0软件设计正、反义引物和探针，引物和探针均由上海生工公司合成和修饰，见表1。

表1 检测小鼠TNF-α和GAPDH的引物探针

1.5 实时荧光PCR

总反应体系为25 μL，包括cDNA模板2 μL，50 mmo1/L MgC12溶液1.5 μL，IMMOLASE DNA热启动酶0.2 μL，100 μmo1/L TNF-α及GAPDH正、反义引物和探针均为0.04 μL，40 mmo1/L 4×dNTP 1 μL，10×缓冲液2.5 μL，双蒸水补足至25 μL。循环参数：95℃预变性10 min；95℃5 s，60℃27 s（温度转换率为4.4℃/s），共40个循环，60℃收集荧光数据。反应在LightCyc1er 480Ⅱ型荧光定量PCR扩增仪上进行。

1.6 质粒载体构建

分别构建TNF-α及GAPDH的载体，扩增产物片段送上海生工公司克隆并测序。

1.7 灵敏度和检测范围

分别选取TNF-α和GAPDH载体作为模板，经10倍梯度稀释（4×101～4×106），按上述条件进行荧光定量RT-PCR。

1.8 统计学分析

应用GraphPad Prism 5.0对数据进行统计学分析，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结果判断

TNF-α在FAM通道出现明显“S”形扩增曲线，在CY5通道无扩增；GAPDH在CY5通道出现明显“S”形扩增曲线，在FAM通道无扩增，分别读取Ct值。

2.2 准确性分析

选取TNF-α和GAPDH的样本各一份送至上海生工公司测序，经BLAST比对后，RT-PCR结果与测序结果一致。测序图如图1。

2.3 标准曲线的建立及灵敏度检测

该法检测TNF-α和GAPDH的灵敏度均为4×101拷贝/μL，TNF-α标准曲线的方程为Y= -3.566X+42.60，r2=0.988，扩增效率为91％。GAPDH标准曲线的方程为Y=-3.541X+38.57，r2=0.996，扩增效率为92％。其中Y代表Ct值，X代表模板量的对数值。其线性范围可达6个数量级（图2和图3）。

2.4 批间重复性

将4×106拷贝/μL的TNF-α和GAPDH混合作为标准品原液进行10倍梯度稀释，批内设置3个复孔，批间重复检测3次，批内和批间变异系数小于3.53％。见表2和表3。

2.5 脂多糖刺激Ana-1细胞前后TNF-α mRNA表达的差异

双荧光通道RT-PCR结果显示，脂多糖处理后Ana-1细胞表达TNF-α mRNA显著高于对照组（t= 21.20，P＜0.01），差异有统计学意义。见图4。

A、B为TNF-α，C、D为GAPDH图1 TNF-α产物测序图

图2 TNF-α不同稀释度扩增曲线

图4 TNF-α mRNA在Ana-1细胞中的表达

图3 GAPDH不同稀释度扩增曲线

3 讨论

在炎症的发生发展过程中，巨噬细胞表面的模式识别受体可以识别多种病原相关分子模式（pathogen-associated mo1ecu1ar pattern，PAMP）分子启动胞内信号传导［3］。根据活化方式的不同巨噬细胞可以分为经典活化型（M1）和替代活化型（M2）两种表型，脂多糖刺激后主要分化为M1a型，激活NF-κB通路表达TNF-α，IL-1β，IL-6等促炎细胞因子，而M2型巨噬细胞表达IL-10等抑炎细胞因子，降低炎症反应促进组织修复［4］。TNF-α是维持体内免疫平衡的重要介质，在抗肿瘤、免疫防御的炎症反应中起重要的作用。巨噬细胞经脂多糖刺激后在早期即可释放大量TNF-α，TNF-α反向作用于NF-κB通路，促进其他炎症因子的释放，放大了炎症反应［5］。因此，通常选取急性炎症早期细胞因子TNF-α作为衡量炎症反应模型成功与否的标准。

表2 TNF-α标准品的批内、批间重复性

表3 GAPDH标准品的批内、批间重复性

多重PCR法通常用在同一反应管内检测多个基因的表达或多种病原体。该方法缩短了检测周期，并降低了检测费用。传统的单重荧光定量PCR在检测多个基因时需要多管反应体系，不但耗费试剂、样本，而且还浪费时间，较为烦琐。

在定量研究目的基因表达水平时，通常会选取GAPDH作为内参基因。如果用单重荧光定量PCR检测目的基因和内参基因，需要分两管进行，会在模板（cDNA）加样环节产生一个加样误差。为避免这个误差并减少PCR次数，本研究旨在建立一种单管快速准确检测TNF-α和GAPDH的方法，利用Primer Premier 5.0软件设计出针对TNF-α和GAPDH高度特异的引物和探针，分别用FAM和CY5荧光基团标记。在以同一浓度阳性核酸作为模板的反应体系中，优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值选择最佳引物和探针浓度，建立最优化的反应体系。LightCyc1er480Ⅱ型实时荧光定量PCR仪进行检测后，分别在FAM和CY5通道读取TNF-α和GAPDH的Ct值，扩增曲线为典型的“S”形。灵敏度实验表明，检出限可达4×101拷贝/μL，无交叉反应，批内和批间重复性好，在106～101拷贝/μL范围内具有良好的线性，可以准确测定TNF-α的表达量，为炎症模型建立成功与否提供了一个准确、经济、快速的检测方法。利用该方法定量检测脂多糖诱导前后Ana-1细胞TNF-α的表达，结果显示诱导组明显高于对照组，说明炎症模型建立成功。

［1］ Morris MC，Gi11iam EA，Li L.Innate immune programing by endotoxin and its patho1ogica1 consequences［J］.Front Immuno1，2014，5：680

［2］ Li Y，Wu Q，Deng Y，et a1.D（-）-Sa1icin inhibits the LPS-induced inf1ammation in RAW264.7ce11sand mouse mode1s［J］.Int Immunopharmaco1，2015，26（2）：286-294.

［3］ Mcnab F，Mayer-Barber K，Sher A，et a1.Type I interferons in infectious disease［J］.Nat Rev Immuno1，2015，15（2）：87-103.

［4］ Liu K，Zhao E，I1yas G，et a1.Impaired macrophage autophagy increases the immune response in obese mice by promoting proinf1ammatory macrophage po1arization［J］.Autophagy，2015，11（2）：271-284.

［5］ Napetschnig J，Wu H.Mo1ecu1ar basis of NF-κB signa-1ing［J］.Annu Rev Biophys，2013，42：443-468.

Establishment of dual fluorescent quantitative real-time PCR for detection of TNF-α

YA0 Shuang，ZHENG Lu，YU Yang，YU Miao-mei，PAN Li-ii，ZHANG Jun，FENG Yue-hua，LU0 Guang-hua
（Comprehensive Laboratory，the Third Affi1iated Hospita1 of Soochow University，Changzhou Jiangsu 213003，China）

Objective：Estab1ish a dua1 f1uorescent quantitative rea1-time PCR for detection of TNF-α. Methods：The RNA was iso1ated from Ana-1 ce11 1ine after inducing by 1ipopo1ysaccharide.Primers and probes were designed according to mice TNF-α and GAPDH gene.The thresho1d cyc1es were reading through channe1 FAM and channe1 CY5，respective1y.After verifying the amp1ification resu1ts by gene sequencing，the standard p1asmid was constructed for ana1yzing the sensitivity and repeatabi1ity of the method. Results：The ana1ytica1 sensitivities of the dua1 rea1-time PCR assay for TNF-α and GAPDH reached to 4× 101copies/μL.No cross-reaction was observed during the reaction.The 1inear range and the intra-assay coefficient of variation were 4×101_4×106copies/μL and＜3.53％.Conclusion：The new method can e-1iminate the errors caused by adding samp1es.It is a simp1e，economic and suitab1e method for assaying expression of target genes.

dua1 f1uorescent quantitative RT-PCR；TNF-α；GAPDH

R393

A

1671-7783（2015）06-0524-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150190

2015-08-28 ［编辑］ 何承志

国家自然科学基金资助项目（81201352，81370372）；江苏省自然科学基金资助项目（BK2012154，BK20130244）；常州市应用基础研究项目（CJ20122013）

姚霜（1989—），女，硕士研究生；罗光华（通讯作者），研究员，硕士生导师，E-mai1：shineroar@163.com