慢性乙型肝炎抗病毒治疗对乙型肝炎病毒X蛋白表达的影响

钱贤峰，吴昌平，徐 君，郑中伟，葛国洪，邵江波

（1.苏州大学附属第三医院肿瘤生物治疗中心，江苏常州213003；2.常州市第三人民医院消化内科，江苏常州213001；3.镇江市第三人民医院感染科，江苏镇江212005）

慢性乙型肝炎抗病毒治疗对乙型肝炎病毒X蛋白表达的影响

钱贤峰1，吴昌平1，徐 君2，郑中伟2，葛国洪3，邵江波3

（1.苏州大学附属第三医院肿瘤生物治疗中心，江苏常州213003；2.常州市第三人民医院消化内科，江苏常州213001；3.镇江市第三人民医院感染科，江苏镇江212005）

目的：观察慢性乙型肝炎抗病毒治疗对乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）表达的影响。方法：选取96例慢性乙肝初治患者，其中HBeAg阳性56例，HBeAg阴性40例。两组患者组内平均分为聚乙二醇干扰素α-2a治疗组（干扰素组）和恩替卡韦治疗组。聚乙二醇干扰素（180 μg，每周1次）疗程48周，恩替卡韦（0.5 mg，1次/d）疗程96周。应用蛋白质印迹法检测治疗前和治疗后48周、96周3个时点各组病例肝组织内HBx的表达。结果：所有患者治疗前肝组织HBx均为阳性表达。治疗后48周，HBeAg阳性干扰素组、恩替卡韦组，以及HBeAg阴性干扰素组、恩替卡韦组HBx阴性表达率别为73.08％（19/26）、40.74％（11/27）、42.11％（8/ 19）、45.00％（9/20）。治疗后各组HBx阴性表达率均明显高于治疗前（P均为0.00）。HBeAg阳性干扰素组HBx阴性表达率明显高于其他3组（P均＜0.05）。恩替卡韦治疗96周时，HBeAg阳性组和HBeAg阴性组HBx阴性表达率无明显差异［48.15％（13/27）、55.00％（11/20）］，和48周时比较也无明显差异（P均＞0.05）。结论：干扰素用于HBeAg阳性的慢性乙肝患者，其抑制X蛋白表达的效果明显优于恩替卡韦。

慢性乙型肝炎；乙型肝炎病毒X蛋白；恩替卡韦；干扰素

肝细胞癌是常见的恶性肿瘤，我国每年约有38.3万人死于肝癌，约占全球肝癌死亡病例数51％，发生率和病死率均位居全球各国肝癌首位［1］。我国原发性肝癌的首要病因是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的慢性感染。在HBV持续感染过程中，病毒的大量复制及其引发的慢性炎症促进了肝细胞癌的发生和发展［2］。导致HBV相关性肝癌发生的病毒学因素有HBV DNA水平、HBeAg阳性持续时间、HBV病毒基因型、C区启动子变异、X基因变异等，因此通过抗病毒治疗降低HBV复制水平是防治乙肝相关性肝癌的关键［3-4］。

HBV主要存在4个编码区，其中HBx基因编码X蛋白。HBx是一种重要的多功能调节蛋白，在肝癌的发生和发展过程中具有重要作用［5］。由于X蛋白并不释放至肝细胞外，因此无法利用血清学实验检测，只能应用免疫组化或者蛋白质印迹法对肝组织活检标本进行检测。这就需要患者接受创伤性操作。目前慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗药物主要分为干扰素和核苷类似物（nuc1eotide ana1ogues，NAs）两类。临床研究热点关注于HBV DNA抑制效率、HBsAg和HBeAg的血清学转换、NAs耐药处理等问题。受限于HBx检测方法，有关抗病毒治疗对于HBx表达影响的研究较少。为此，本研究检测了干扰素和NAs抗病毒治疗后患者肝脏活检组织HBx的表达，探讨抗病毒治疗在HBV相关性肝癌防治方面新的作用机制。

1 对象与方法

1.1 病例

随机选取2012年1月至2013年6月常州市第三人民医院、镇江市第三人民医院收治的部分慢性乙肝初治患者96例，年龄23～51岁，诊断符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》标准。同时排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒感染，排除酒精性肝病、自身免疫性肝病、恶性肿瘤、糖尿病、精神疾病患者，排除妊娠、哺乳期患者，排除存在恩替卡韦耐药基因患者。所有患者治疗前均进行医学伦理学评估，并告知抗病毒治疗可能发生的不良反应、病毒耐药可能，签署知情同意书。

1.2 病例分组

依据2010年《慢性乙型肝炎防治指南》标准，将96例慢性乙型肝炎患者分为2组。HBeAg阳性组56例，年龄23～48岁，平均（39.6±7.28）岁；HBeAg阴性组40例，年龄25～51岁，平均（42.5± 8.85）岁。两组患者年龄间差异无统计学意义。两组患者各自组内平均分为聚乙二醇干扰素（pegy1ated-interferon a1fa-2a，Peg-IFNα-2a）治疗组（干扰素组）和恩替卡韦治疗组（恩替卡韦组）。

1.3 抗病毒方案

Peg-IFNα-2a（上海罗氏制药公司）180 μg，每周皮下注射1次，疗程48周。恩替卡韦（中美上海施贵宝制药有限公司）0.5 mg，1次/d，空腹口服，疗程96周。治疗期间有任何因素导致中途停药或者换药的患者，判定为样本脱落。

1.4 观察项目

各组患者分别于治疗前以及治疗后48周、96周进行肝脏穿刺活检，以蛋白质印迹法检测肝组织内HBx的表达。

1.5 主要试剂和仪器

兔抗人HBx单克隆抗体、β-肌动蛋白抗体均为美国Santa Cruz公司产品，辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔二抗为美国Ce11 Signa1ing Tech公司产品。KR25i高速离心机（美国Thermo公司），Bio-Rad电泳仪、转膜仪、凝胶成像仪（北京赛百奥科技有限公司）。

1.6 实验方法

1.6.1 肝组织样本处理 肝脏穿刺后肝组织样本用NaC1-EDTA-Na2溶液洗去血液，再用预冷PBS溶液洗涤2次，加入含1％PMSF细胞裂解液，超声破碎细胞，15 000 r/min离心5 min，取上清液-70℃保存。

1.6.2 蛋白质印迹法检测HBx蛋白的表达 样本检测前，将十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白上样缓冲溶液和待检蛋白按体积4∶1混匀，100℃煮沸5 min使蛋白变性。取等量蛋白上样，15％SDS-PAGE分离蛋白并转膜，5％脱脂牛奶室温封膜80 min，加入HBx一抗（1∶1 000），4℃缓摇孵育过夜；次日换液洗膜加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温缓摇2 h，洗膜后采用电化学发光法在凝胶成像仪显像，PDQuest软件进行图像分析（β-肌动蛋白为内参蛋白）。分别计算各样本蛋白和β-肌动蛋白积分光密度比值，比值＞1.0判定为HBx蛋白表达阳性。

1.7 统计学方法

应用SPSS 16.0统计学软件，计量资料采用t检验，率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例脱落

因药物不良反应和治疗依从性不良导致的样本脱落病例数：HBeAg阳性Peg-IFNα-2a治疗组2例，HBeAg阳性恩替卡韦治疗组1例，HBeAg阴性Peg-IFNα-2a治疗组1例，HBeAg阴性恩替卡韦治疗组无脱落。4例脱落事件均在治疗48周内发生。

2.2 治疗48周各组HBx的表达

抗病毒治疗前所有慢性乙肝患者HBx均为阳性表达。48周治疗结束时，各组患者HBx阴性表达率均比治疗前明显增高（P均为0.00）。干扰素用于HBeAg阳性病例治疗时HBx阴性表达率（19/ 26）明显高于恩替卡韦治疗的病例（11/27），也明显高于HBeAg阴性干扰素组（8/19）。而HBeAg阴性恩替卡韦组（9/20）和同组的Peg-IFNα-2a治疗组以及HBeAg阳性恩替卡韦治疗组的HBx阴性表达率无明显差异（P＞0.05）。见表1。结果显示，干扰素用于HBeAg阳性的慢性乙肝治疗，抑制HBx表达的效果明显优于恩替卡韦。

表1 抗病毒治疗48周HBx阴性表达的病例分布

2.3 恩替卡韦治疗96周HBx的表达

应用恩替卡韦治疗的患者有47例维持治疗至96周。其中，27例HBeAg阳性患者中，HBx阴性表达率为48.15％（13例）；20例HBeAg阴性患者中，11例HBx为阴性表达（55.00％）。HBeAg阳性组与阴性组HBx阴性表达率间的差异无统计学意义（χ2=0.216，P＞0.05）。而且，HBeAg阳性组与治疗48周时HBx阴性表达率比较，也无明显差异（χ2=0.300，P＞0.05）；HBeAg阴性组与治疗48周时的HBx阴性表达率间的差异亦无统计学意义（χ2=0.400，P＞0.05）。

3 讨论

HBx主要通过与核转录调节子的相互作用或激活信号传导途径，促进细胞周期进程、调节细胞凋亡、抑制肿瘤抑制基因的表达，从而促进肝癌的发生、发展［6-8］。高HBV DNA载量是乙肝病毒慢性感染者发生肝硬化、肝细胞癌的重要危险因素［9-10］，HBx C-端反式激活作用区域转录反式激活作用可能对增强HBV的复制能力至关重要［11］。Keas1er等［12-14］的体外实验也证明HBx对HBV高复制水平是必需的。甲基化是细胞癌变过程中基因转录发生改变的最可能机制之一［15］。汤绍辉等［16］发现，HBx可以通过诱导P3启动子低甲基化促进肝癌胰岛素样生长因子-Ⅱ（IGF-Ⅱ）表达。Tong等［17］和Zheng等［18］也分别发现多个由HBx激活的启动子呈低甲基化的基因。以上结果均表明，HBx表达水平在HBV相关性肝癌的发生和发展过程中具有极其重要的作用，因此降低HBx表达水平可以有效预防肝癌的发生。本研究所有患者在抗病毒治疗前HBx均为阳性表达，经过干扰素和NAs治疗后HBx的表达明显下降，说明抗病毒治疗能有效降低肝细胞癌的发生。

干扰素和NAs具有不同的抗病毒机制。干扰素具有免疫调节和抗病毒的双重作用，通过增强HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）功能、经干扰素信号通路产生多种抗病毒蛋白等多个环节作用于HBV复制、转录等重要生物学过程，达到抗病毒及增强机体免疫功能的效果。NAs则主要通过竞争性抑制HBV DNA多聚酶的关键位点，直接抑制病毒复制，进而改善肝组织炎性反应。HBeAg阳性慢性乙肝患者和HBeAg阴性患者有诸多不同的临床特点。HBeAg阴性慢性乙肝患者HBV变异更多发生在前C区、基本核心启动子区（BCP），虽不表达或低表达HBeAg，但病毒仍能复制和装配，导致肝组织产生活动性炎症，自发缓解罕见，病变反复活动更易进展为肝硬化，也是肝细胞癌的高发人群，因此抗病毒疗程更长，且应答率低［19-20］。本研究结果显示，在相同疗程下选择Peg-IFNα-2a治疗的HBeAg阳性慢性乙肝患者HBx阴性表达率明显高于HBeAg阴性患者，说明在HBx阴转应答方面，HBeAg阳性患者优于HBeAg阴性患者，符合以上观点。而在同样疗程下，选择恩替卡韦治疗无论48周还是96周，HBeAg阳性患者和阴性患者在HBx阴性表达率方面均未见明显差异。这可能与NAs的抗病毒机制有关。由于NAs不具有免疫调节作用，不能提高细胞免疫水平，抑制HBx表达的作用弱于干扰素，这和以往干扰素抗病毒治疗对于HBeAg血清学转换率和HBsAg阴转率高于NAs的研究结果类似［21-24］。继续延长恩替卡韦疗程，HBeAg阳性患者和HBeAg阴性患者HBx阴性表达率是否出现差异，我们将继续观察。

本研究显示，HBeAg阳性慢性乙肝患者抗病毒治疗选择Peg-IFNα-2a较恩替卡韦能获得更高的HBx阴性表达率，这仍然和干扰素独特的免疫调节作用密切相关。而在HBeAg阴性慢性乙肝患者中，两种药物对HBx的阴转率无明显差异，我们推断和HBx基因普遍存在变异以及HBV基因型有关。越来越多的研究表明［25-27］，联合应用抗病毒药物治疗慢性乙型肝炎，能明显提高HBV DNA抑制率、HBeAg血清转换率和HBsAg转阴率，但能否提高HBx阴性表达率尚需进一步研究。

综上，本研究结果显示，抗病毒治疗能有效抑制HBx的表达，对于防止肝癌的发生起到重要作用。HBeAg阳性慢性乙肝患者首选Peg-IFNα-2a抗病毒治疗在抑制HBx表达方面优于恩替卡韦。属于肝癌高危人群的慢性乙肝患者如能够接受肝脏穿刺活检，在抗病毒过程中监测HBx表达水平对预测肝癌的发生有临床意义。

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Effect of antiviral treatment for chronic hepatitis B patients on hepatitis B virus X protein expression

QIAN Xian-feng1，WU Chang-ping1，XU Jun2，ZHENG Zhong-wei2，GE Guo-hong3，SHA0 Jiang-bo3
（1.Department of Tumor Bio1ogica1 Treatment，the Third Affi1iated Hospita1 of Soochow University，Changzhou Jiangsu 213003；2.Department of Digestive Diseases，the Third Peop1e′s Hospita1 of Changzhou，Changzhou Jiangsu 213001；3.Department of Infectious Diseases，the Third Peop1e′s Hospita1 of Zhenjiang，Zhenjiang Jiangsu 212005，China）

Objective：To investigate the variation of hepatitis B virus X（HBx）protein expression during antivira1 treatment for chronic hepatitis B（CHB）patients.Methods：Fifty-six naïve CHB patients with HBeAg-positive and 40 naïve CHB patients with HBeAg-negative were divided random1y into the pegy1ated-interferon（Peg-IFN）therapy group receiving Peg-IFNα-2a（180 μg/week）for 48 weeks and entecavir therapy group receiving entecavir（0.5 mg/d）for 96 weeks.A11 patients were tested hepatic tissue for the HBx protein expression 1eve1s by Western-b1otting method at treatment weeks 0，48，and 96. Results：At week 0，The HBx protein expression of a11 patients were positive.At week 48，the rates of the HBx protein negative expression in Peg-IFNα-2a therapy group and entecavir therapy group with HBeAg-positive，and in Peg-IFNα-2a therapy group and entecavir therapy group with HBeAg-negative，were 73.08％（19/26），40.74％（11/27），42.11％（8/19），45.00％（9/20），and were significant1y different from at week 0（a11 P va1ues were 0.00）；then，the rate in Peg-IFNα-2a therapy group was significant difference from others three groups（a11 P va1ues were 1ess than 0.05）.At week 96，the rates of the HBx protein negative expression had no significant difference in entecavir therapy group with HBeAg-positive and with HBeAg-negative［48.15％（13/27），55.00％（11/20）］；and compared at week 48，the resu1ts were simi1ar（A11 P va1ues were greater than 0.05）.Conclusion：Compared to entecavir，Peg-IFN was more potent to suppress the HBx protein expression.

chronic hepatitis B；hepatitis B virus X protein；entecavir；interferon

R512.62

A

1671-7783（2015）06-0498-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150215

2015-09-25 ［编辑］陈海林

江苏省自然科学基金资助项目（BK2006083）

钱贤峰（1979—），女，江苏宜兴人，主治医师，硕士研究生，主要从事肝硬化、肝癌临床诊疗研究；吴昌平（通讯作者），主任医师，硕士生导师，E-mai1：wcpjjt@163.com