甜茶果实水提物HPLC分析及抗氧化性分析

湛志华　薛茗月　李晓红　陈全斌　马剑霜

摘 要 甜茶果实的水提取物经高效液相色谱检测未发现有山奈酚、槲皮素等甜茶植株中常见的黄酮苷元，但发现含有鞣花酸，测定其含量约为0.58%。采用紫外可见光分光光度法分析了甜茶果实提取物的抗氧化能力，结果表明，甜茶果实提取物具有较强的清除自由基和抗氧化能力，其清除自由基能力和抗氧化能力均比人工合成抗氧化剂BHT强。

关键词 甜茶；果实；化学成分；分离纯化

中图分类号：S571；S663.2 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2015）30--03

食品添加剂的安全性和毒副作用随着人类生活水平的提高和绿色工业的兴起而越来越受到关注，BHA、BHT、TBQH等常用合成抗氧化剂的使用则越来越受到限制。因此，从天然产物中寻找毒副作用小安全性高的天然抗氧化剂已成为近年来的研究热点。大量研究显示[1， 2]广西甜茶中含有黄酮类和酚酸类天然抗氧化活性物质。广西甜茶（Leaf of Strigose Hydrangea）是蔷薇科悬钩子属植物，是广西特产。陈全斌等[3， 4]从甜茶中分离得到了鞣花酸、黄酮苷元槲皮素和山奈酚。鞣花酸是一种植物多酚类化合物，已有文献报导其可以抗衰老、增加肌体免疫，具有较强的防癌功效，且能抗脂质过氧化、抗诱变及捕捉自由基，是一种亟待开发的天然抗氧剂[5]。陈全斌等已对甜茶植株的根、茎、叶和花中黄酮苷元及鞣花酸含量进行了测定，而整个植株中黄酮及鞣花酸的分布规律、甜茶果提取物抗氧化能力等课题有待进一步深入研究。本文利用高效液相色谱对甜茶果实的水提物进行HPLC分析，采用紫外可见光分光光度法分析了甜茶果水提精制样品的抗氧化活性，并与合成抗氧化剂2、6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）比较。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 材料与试剂

甜茶果（广西金秀）、甲醇、硫酸、磷酸钠、盐酸、磷酸、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、BHT、二苯代苦味酰自由基（DPPH）、钴酸铵、山奈酚和槲皮素的标准品（中国药品生物制品检定所）；鞣花酸标准品（Sigma-Aldrich）。

1.1.2 仪器

P200Ⅱ型高效液相色谱仪（大连依利特公司）、HHSⅡ-4型电热恒温水浴锅、722型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、E-52A旋转蒸发仪、BP211D型电子天平。

1.2 实验方法

1.2.1 HPLC分析甜茶果实水提酸解产物

甜茶果水提酸解样品的制备：破碎烘干甜茶果实样品1 g→加入氯仿25 mL回流30 min→过滤→真空干燥滤渣→甲醇30 mL回流1 h→过滤→滤液与10 mL1∶1HCl溶液混合→加熱水解1 h→甲醇定容至50 mL待测。

甜茶果水提液样品制备：准确称取干燥甜茶果1.020 g粉碎→加入150 mL蒸馏水回流提取3 h→定容至500 mL。

黄酮苷元标准溶液的配制 分别配制浓度为0.1563 mg/mL的山奈酚和0.1324 mg/mL的槲皮素标准溶液，然后1∶1混合。

0.1 mg/mL鞣花酸标准溶液的配制：鞣花酸标准品10.00 mg→甲醇溶解并定容至100 mL。

HPLC色谱条件：Hypersil ODS（5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱；流动相V甲醇∶V水∶V磷酸=60∶40∶0.3；流速1.0 mL/min；在波长360 nm处检测黄酮类物质，在波长270 nm处检测鞣花酸；柱温30 ℃；灵敏度0.005；进样20 μL。

1.2.2 样品成分HPLC分析

分别准确吸取甜茶果水提酸解待测溶液和黄酮苷元标准溶液20 ?L进行HPLC分析，根据保留时间定性方法，以确定甜茶果中黄酮苷元的成分及含量见图1。

采用工作曲线法测定甜茶果中鞣花酸的含量。通过外标法测定鞣花酸的质量（μg）和峰面积（mv.min）之间的关系绘制标准曲线，标准样品的色谱图如图2（a）所示，样品色谱图见图2（b）。根据HPLC保留时间定性方法确定图2（a）中t=5.24min处的吸收峰对应物质为鞣花酸。经计算，甜茶果中鞣花酸含量为0.58%。

1.2.3 甜茶果水提取物抗氧化性研究

甜茶果水提精制样品制备 取干甜茶果100 g→加水（1∶10）煮沸120 min→冷却过滤→浓缩、干燥→深褐色甜茶果粗提物→无水乙醇溶解→过滤→浓缩干燥→黄色精制样品。

不同浓度样品的清除DPPH自由基实验：精确称取精制样品，配置浓度为0.2、0.5、0.8、1.2 mg/mL的甲醇溶液；分别取0.2 mL与8 mL0.004%的DPPH甲醇溶液混合，30 ℃恒温水浴条件下反应。每10 min测定一次515 nm处的吸光度直到反应完全；另外，测定各样品溶液吸光度和不含甜茶果提取物的空白样品吸光度。根据公式S（%）=（1-A样品/A空白）×100%计算清除率，作S-t图[图3（a）]。配置0.5mg/mL的BHT甲醇溶液，测定同浓度下（0.5 mol/L）样品与BHT的吸光度，作S-t图[见图3（b）]。

甜茶果水提物总抗氧化性实验从2个方面考查。一是测定样品在不同浓度下的总抗氧化性比较，再就是特定浓度下的样品与BHT总抗氧化性的比较。

样品不同浓度下总抗氧化性测定：在10 mL具塞刻度比色管中依次加入甜茶果水提取物的样品甲醇溶液1 mL，0.6M H2SO4溶液1.0 mL，0.004M（NH4）6Mo7O24溶液1.0 mL，0.028M Na3PO4溶液1.0 mL→定容至5 mL→95 ℃水浴→每30 min测一次695 nm波长处吸光度。配置0.1 mg/mL的BHT溶液做阳性对照，作A-t图[图4（a）]。

特定浓度下总抗氧化性测定 配置0.5 mg/mL各样品溶液和BHT溶液，测定其吸光度，作A-t图[图4（b）]。

2 结果与分析

2.1 甜茶果水提取物HPLC分析

从图2可以看出，甜茶叶和茎中含有槲皮素和山奈酚在甜茶果果实中没有被检出；果实中鞣花酸的含量为0.58%。已有文献显示，甜茶根、茎、叶、花中，鞣花酸含量分别为0.10%、0.07%、0.06%、1.85%，果实中鞣花酸的含量仅次于甜茶花中的含量，而采集甜茶花是很困难的。因此，从甜茶果实中提取分离天然抗氧化剂鞣花酸作为保健品添加剂具有广阔的应用前景。

2.2 甜茶果水提物清除DPPH自由基[11]效应

不同浓度甜茶果水提精制样品对DPPH的清除率测定结果见图3（a），甜茶果水提物有较强的清除自由基的能力，这是因为甜茶果富含鞣花酸等酚酸类化合物。图3（a）显示，随着浓度的增大，果实提取物的自由基清除能力越大；不用浓度的样品对自由基的清除率均在反应前10 min就达到了最大值，随后变化值不大，说明清除自由基的速率比较快；最大的清除率约为80%，浓度为0.5 mg/mL时达到最大清除率，浓度大于0.5 mg/mL时，清除率增加不明显。由图3（b）可知，BHT清除自由基速率不及甜茶果水提精制样品，人工合成抗氧化剂BHT达到最大清除率需要反应约70 min，而精制样品在越10 min时即达到最大清除率，且同浓度下BHT的最大清除率小于甜茶果水提精制样品。综上所述，甜茶水提精制样品对DPPH自由基的清除作用要优于BHT。

2.3 各樣品的总抗氧化性分析

不同浓度下甜茶果水提精制样品总抗氧化能力的A-t图见4（a）。图4（b）为0.5mol/L样品与BHT总抗氧化性的A-t图。图4显示甜茶果水提取的精制样品的抗氧化性较强，随着反应时间的延迟及样品浓度的增大其抗氧化能力表现越强，0.5 mol/L甜茶果水提样品的总抗氧化性明显优于BHT。

3 结论

1）广西甜茶果实中不含有槲皮素和山奈酚苷元；鞣花酸的含量为0.58%。

2）甜茶果实水提精制样品有较强的清除自由基的能力，自由基清除反应10 min后达到了最大清除率；0.5 mg/mL甜茶水提取物自由基清除速率明显优于0.5 mg/mL BHT，其总抗氧化的能力也比BHT强。

3）鞣花酸是优秀的天然抗氧化添加剂，甜茶果实作为保健食品加以开发和利用具有广阔的应用前景。

参考文献

[1]邓绍林.广西甜茶叶片的营养成分及开发利用价值研究[J].中国林副特产，2000（3）：18-19.

[2]颜小捷，卢凤来，李典鹏.甜茶化学成分及药理作用研究进展[J].广西植物，2013（1）：136-142.

[3]卢昕，张新申，刘承伟.反相液相色谱法测定广西甜茶中的甜茶素[J].色谱，2003，21（3）：260-262.

[4]陈全斌，沈钟苏，张巧云.甜茶中黄酮甙元的分离提纯及其表征[J].林业科技，2005，30（1）：46-48.

[5]马书荣，曲笑岩，祖元刚.温室内长春花总黄酮含量的动态变化研究[J].植物研究，2006，26（2）：211-215.

（责任编辑：刘昀）