柑橘精油风味发酵乳的开发与评价*

郭秀兰，唐仁勇，周子涵，王思源，潘鸿，黄海霞

(成都大学生物产业学院，四川成都，610106)

柑橘精油主要存在于柑橘皮的油胞中，约为果皮鲜重的0.5%～2%［1］，主要由萜烯类物质及其含氧衍生物如高级醇类、醛类、酸类、酯类及一些饱和烷烃类、酚类等物质组成［2］。柑橘精油具有抑菌、消炎、祛痰、止咳、促进消化、镇痛、溶解胆结石等作用，此外还具有使人体中枢神经镇静和减轻人体应激，消除疲劳的作用［3］。柑橘精油无色透明，气味清新怡人，具有令人愉悦的天然柑橘香气，可作为食品的天然香味剂，在饮料、调味品、糖果、饼干、点心、冰淇淋等食品广泛应用［3－4］。另外柑橘精油是一种安全的抗菌剂，对食品中多种微生物都有较好的抑制效果，应用于鲜切果蔬、肉制品、乳制品等的防腐保鲜［1，5］。

柑橘精油可作为发酵乳的天然香味剂，增强发酵乳的果味和保健作用，但柑橘精油本身具有抑菌作用，是否对发酵乳的发酵产生负面影响呢?本研究探讨了柑橘精油对发酵乳发酵菌株保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)和嗜热链球菌(S.thermophilus)的抑菌作用和发酵乳品质的影响，为拓宽柑橘精油的利用和开发发酵乳新品种提供理论依据和工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与主要仪器

1.1.1 材料

椪柑:市售新鲜椪柑;奶粉:市售伊利全脂奶粉;白糖:市售;发酵剂:丹麦科汉森直投发酵乳发酵剂;嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌由中国普通微生物菌种保藏中心提供。

1.1.2 主要仪器设备

牛津杯内径(6.0±0.1)mm，外径(7.8±0.1)mm，高(10.0±0.1)mm;H-250型生化培养箱，上海一恒科技有限公司;2HJH-C1209B型超净工作台，上海智诚分析仪器制造有限公司;D2KW-4型电子恒温水浴锅，北京中兴伟业有限公司;BCD-228SCHA型新飞电冰箱，新飞电器集团有限公司;YX280A型手提式不锈钢蒸汽消毒器，上海三种医疗器械有限公司;TGL-16G离心机，上海安亭科学仪器厂;pHS-3C型精密pH计，上海医疗器械五厂。

1.2 实验方法

1.2.1 精油的提取

剥取新鲜椪柑皮，切碎，选用Clevenger装置，采用水蒸汽蒸馏法［6］进行精油的提取，工艺参照文献［7］。

1.2.2 精油的抑菌试验

嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌分别用MRS和M17培养基进行活化，37℃培养制成细菌悬液，细菌使用平板计数法，调至浓度为含菌体106～107个/mL的菌悬液。将各种待测菌悬液各取0.2 mL在相应的固体培养基上均匀涂布，制成含菌平板，每个培养皿均匀放置3只牛津杯。吸取一定稀释浓度(1、10－1、10－2、10－3)的柑橘精油0.15 mL至相应的牛津杯中，每浓度3个重复，37℃培养48 h，观察结果。

1.2.3 柑橘精油发酵乳的制作工艺

1.2.3.1 工艺流程

奶粉 → 还原奶 → 配料(加糖)→加热灭菌(90℃、5 min)→冷却(40℃)→加精油→ 接种→装罐→发酵(42℃)→冷却后成熟(4℃)→成品

1.2.3.2 工艺要点

还原奶的制备:按奶粉与水的质量体积比为15∶100配制，再加入7%的白糖，充分溶解，混匀。

杀菌、冷却:混合好的料液在90℃下保温5 min杀菌，冷却至40℃，备用。

加精油和接种:在超净工作台中，将混合液加入适量的柑橘精油(0、450、700、950、1 200 μL/L)，并接种一定量的发酵剂，充分混合均匀。

灌装封口、发酵及后成熟:将接种后混合均匀的物料灌装于灭菌的容器中并封口，于42℃恒温培养至凝固取出，并记录发酵时间，放入0～4℃冰箱进行后发酵24 h得成品。

1.2.4 感官质量评价

根据柑橘精油发酵乳气味、口感、组织状态和色泽进行感官评分，挑选10位经过训练的专业人员进行评分，评分标准见表1。

表1 感官评分标准Table 1 Standard of sense score

1.2.5 柑橘精油发酵乳细菌计数

取发酵乳样品2 g，用灭菌生理盐水稀释至10－5，每个处理再取200 μL菌液进行胶注培养，方法参照Kusuma等(2009)［8］。乳酸杆菌采用MRS培养基37℃厌氧培养48 h，嗜热链球菌采用M17培养基42℃厌氧培养48 h，再进行细菌计数。

1.2.6 pH值和酸度的测定

取少量发酵乳用pH计直接测定pH值，发酵乳酸度的测定参照GB 5413.34—2010乳和乳制品酸度的测定［9］。

1.2.7 数据处理

实验数据表示为平均数±标准偏差(SD)，方差分析采用SPSS 14.0单因素方差分析和Duncan＇s多重比较分析。

2 实验结果

2.1 柑橘精油对发酵乳发酵细菌的抑菌结果

柑橘精油具有一定的抑菌作用［5］，可用于食品的防腐保鲜，但高剂量的精油也可能会引起肠道微生态的紊乱或者肠道细胞损伤［10］。本实验考察不同浓度的精油对发酵乳发酵细菌的影响，寻找在发酵乳中添加柑橘精油的适宜浓度。从表2可看出，精油原液对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的抑菌效果非常明显，抑菌圈都远大于15 mm，属于高度敏感［11］，其中嗜热链球菌对柑橘精油更敏感，特别是稀释浓度为10－1时嗜热链球菌的抑菌圈显著高于保加利亚乳杆菌。随着精油浓度的降低，抑菌效果也逐渐降低，10－2时保加利亚乳杆菌在牛津杯中略有生长，而10－3浓度时2种细菌在牛津杯内均有相当数量的生长。因此在发酵乳中添加柑橘精油的稀释浓度控制在10－3左右可能不影响发酵菌种的生长。

表2 不同精油浓度对发酵乳发酵细菌的抑菌圈直径 单位:mmTable 2 Inhibition zone diameter of fermented milk fermentation bacteria with addition of different essential oil concentration

2.2 柑橘精油发酵乳的发酵时间、酸度和pH值

在抑菌试验的基础上，选择1 L发酵乳发酵液中添加 0、450、700、950、1 200 μL 柑橘精油，结果发现添加不同剂量的柑橘精油没有对发酵时间造成显著影响，5个处理的发酵时间(为4 h)基本一致，并且添加不同剂量的柑橘精油发酵乳的pH值和酸度基本一致(表3)，pH值为4.5～4.6，酸度值在92°T左右，符合GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》(酸度值＞70°T)［12］。这些结果说明在发酵液中添加450～1 200 μL/L的柑橘精油没有抑制发酵乳的发酵和乳酸的产生。

表3 添加不同剂量柑橘精油对发酵乳酸度和pH值的影响Table 3 Effect of different dose of citrus essential oil on acidity and pH of fermented milk

2.3 柑橘精油发酵乳的细菌数量

实验检测了0和14 d发酵乳中乳杆菌和嗜热链球菌的数量，结果见表4。柑橘精油的添加略微降低了细菌数量，但没有达到显著性差异，且各个添加剂量对细菌数量的影响也不明显，这与本实验发酵乳发酵时间基本一致的结果相吻合。同时在4℃贮存14d后，2种细菌数量仍然较高，远高于GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》中的 106CFU/mL［12］，因此 1 L 发酵液中添加 450～1 200 μL的柑橘精油未对发酵乳发酵细菌或益生菌数量造成负面影响。

表4 添加不同剂量柑橘精油对发酵乳细菌数量的影响Table 4 Effect of different dose of citrus essential oil on bacteria number in fermented milk

2.4 柑橘精油发酵乳的感官评分

柑橘精油发酵乳的感官评分见表5。柑橘精油的添加对发酵乳的组织状态和色泽影响不大，但对气味和口感有明显改善作用，其中700 μL组的气味、口感评分最高，显著或极显著高于未添加组，其次为450 μL和950 μL组，气味和口感显著高于未添加组，而1 200 μL组各项感官评分接近于未添加组，并显著低于700 μL组。综合各项评分，每升发酵液中添加450～950 μL的柑橘精油可显著提升发酵乳气味和口感，其中700 μL/L的效果最好。

表5 添加不同剂量柑橘精油对发酵乳感官评分的影响Table 5 Effect of different dose of citrus essential oil on sense score of fermented milk

3 结论

柑橘精油具体香甜的果味，也具有较强的抑菌作用，本实验力求降低精油的抑菌作用，将其作为天然香味剂应用于发酵乳。首先通过抑菌实验寻找适宜的柑橘精油添加浓度，在此基础上每升发酵液中添加450～1 200 μL精油，发现对发酵乳的发酵时间、pH值、酸度、乳杆菌和嗜热链球菌的数量没有明显影响，而感官评分表明添加柑橘精油450～950 μL/L可显著提升发酵乳的气味和口感，其中700 μL/L的效果最好。综合这些实验结果表明发酵乳中添加450～950 μL/L的柑橘精油可改善发酵乳气味和口感，提升发酵乳的感官品质，并拓宽柑橘精油的利用途径。

［1］沈妍，傅瑜，陈健初，等.柑橘精油在食品中的抗菌应用［J］.食品工业科技，2009，30(6):315 －318.

［2］陈林林，米强，辛嘉英.柑橘皮精油成分分析及抑菌活性研究［J］.食品科学，2010，31(17):25 －28.

［3］刘涛，谢功昀.柑橘类精油的提取及应用现状［J］.包装与食品机械，2009，27(1):44 －48.

［4］郭润霞，谭兴和，张喻，等.橘皮精油的提取与应用研究进展［J］.食品工业，2011，32(8):100－102.

［5］吴贾锋.柑橘精油的抑菌性研究［J］.中国食品学报，2008，8(2):157 －158.

［6］Cassel E，Vargas R M F，Martinez N，et al.Steam distillation modeling for essential oil extraction process［J］.Industrial Crops and Products，2008，17(4):1 －6.

［7］于文峰.琯溪蜜柚皮中精油提取及色素分离工艺研究［D］.无锡:江南大学，2011.

［8］Kusuma G D，Paseephol T，Sherkat F.Prebiotic and rheological effects of Jerusalem artichoke inulin in low-fat yogurt［J］.Aust J Dairy Technol，2009，64(2):159 － 163.

［9］中华人民共和国卫生部.GB 5413.34－2010.乳和乳制品酸度的测定［S］.北京:中国质检出版社，2010.

［10］Dusan F，Marian S，Katarina D，et al.Essential oils-their antimicrobial activity against Escherichia coli and effect on intestinal cell viability［J］.Toxicology in Vitro，2006，20(8):1 435－1 445.

［11］顾仁勇，张石峰，刘莹莹，等.五种香辛料精油抑菌及抗氧化性能研究［J］.食品科学，2008，29(3):106－108.

［12］中华人民共和国卫生部.GB 19302－2010.食品安全国家标准发酵乳［S］.中国质检出版社，2010.