油田采出水微生物处理菌株选育及特性研究*

杜茂林 谷亚楠 付瑞敏 陈五岭

（1.西北大学生命科学学院；2.河南教育学院人口与生命科学系）

油田采出水微生物处理菌株选育及特性研究*

杜茂林1谷亚楠1付瑞敏2陈五岭1

（1.西北大学生命科学学院；2.河南教育学院人口与生命科学系）

为解决油田采出水微生物处理菌株的应用局限，通过H e-Ne激光和紫外线复合诱变，选育出能够在油田采出水中快速生长，并有效降解油田采出水主要危害成分的5种优势菌株。经形态学和生理生化鉴定，这5株菌分别为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）、多食鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium multivoru m）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）和解脂假丝酵母（Candida tropicalis）。经检验，所筛选的菌株均能降解石油烃类以及聚丙烯酰胺类物质，并对高碱、高温环境有一定耐受性，可将其直接应用于油田采出水的处理。

油田采出水；微生物处理；菌株选育；降解特性

0 引 言

微生物处理技术是通过微生物新陈代谢的生理生化过程来降解油田采出水中的主要危害成分，包括石油烃类、悬浮物等，并促使其转化为自身可利用的无毒无害成分，进而达到去除采出水主要污染物的目的［1-3］。微生物水处理技术已经在城市污水厂和工业污水处理中得到了广泛的应用，近年来，各大油田逐步推广使用。但目前多采用的单一菌种处理含有多组分有机物时普遍存在生化反应器处理量小，不同油井采出水成分差异大，采出水温度高等制约因素。因此利用现代微生物技术开发能够在同一生化反应器中同时降解各类油田污水主要污染物的复合微生物菌剂，并能克服采出水高温、高碱的环境，提高其对不同水型、不同矿化度采出水的适应性具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 采出水样品

采出水样品取自国内主要油田（大庆油田、长庆油田、新疆油田、辽河油田、中原油田）不同处理站采出水样品各3份，样品取回后置于冰箱4℃保存。

1.1.2 试剂

配置微生物分离纯化常用培养基所需试剂及提取、检测用试剂，上述试剂皆为分析纯。

1.1.3 培养基

细菌、放线菌、酵母菌、霉菌斜面以及分离用常规培养基；

富集液体培养基：采出水（样品编号O W1-2）15%，K2H P O4·3 H2O 1.0%，NaCl 0.5%，K H2P O40.4%，NaN O30.2%，（N H4）2SO40.1%，M gSO4·7 H2O 0.025%，p H值调至8.0；

油田采出水平板培养基：油田采出水，2%琼脂；

石油烃类降解用培养基（g/L）：Na H2P O4·H2O 1.0，K H2P O41.0，NaN O30.5，（N H4）2S O40.5，CaCl20.02，M gS O40.2，原油0.1，p H值调至7.0；

聚合物降解用培养基：常规液体培养基中加入聚丙烯酰胺至最终浓度为1 g/L。

1.2 检测方法

活菌数检测：血球板计数法、活菌平板菌落计数法；

p H值测定：p H值用p H S-25数显p H计测定；

石油烃类总量测定［4］：红外光谱法；

悬浮物含量的测定［5］：浊度仪测定法；

聚合物类物质降解率检测［6］：以聚丙烯酰胺降解率为指标，采用淀粉-碘化镉法测定。

1.3 菌株初筛

取采出水样品各1 m L分别加入到装有49 m L富集培养基的摇瓶中，25～35℃下，180 r/min培养48 h，检测总菌数的变化。当菌浓度达到1.0×107cfu/m L左右时，即可利用富集固体培养基（富集液体培养基+2%琼脂）平板涂布法分离纯化。将0.1 m L分离纯化菌株制成的菌悬液涂布到采出水平板培养基，28～35℃恒温培养48 h，选择能够迅速生长的菌株制成菌悬液，重复三次采出水平板培养基培养驯化。选择在采出水平板培养基上生长良好的菌株接入采出水样品O W1-2中，35℃下180 r/min培养72 h，检测采出水中微生物的菌体数、p H值、悬浮物含量和石油烃类含量。分离保存在采出水中生长迅速、对主要危害成分改变较大的菌株作为初筛菌株。

1.4 H e-Ne激光、紫外线复合诱变

利用分离纯化的初筛菌株制备n×108cfu/m L的菌悬液，取10 m L于无菌培养皿中，紫外灯下（15 W，30 cm）诱变90 s，取诱变后菌液0.4 m L于小试管中H e-Ne激光（15 m W，15 cm）辐照10 min，红灯下取复合诱变后的各类菌悬液0.1 m L涂布于采出水平板培养基，28～35℃恒温培养48 h。重复三次培养驯化，挑选在采出水平板上长势良好的菌株进行复筛［7］。

1.5 菌株复筛

将诱变后选育出的优势菌株活化后接入1 L油田采出水样品O W1-2中，35℃下180 r/min培养72 h，检测采出水中微生物的菌体数、p H值、悬浮物以及石油烃类含量，确定各菌株在采出水中的繁殖生长状况。将繁殖生长迅速、对采出水污染主要指标改变较大的菌株逐一挑选出来，分离纯化后保存待用。

1.6 菌株鉴定

1.6.1 形态学鉴定

细菌的形态学鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》［8］，培养24 h后观察菌落形态，进行革兰氏染色、结晶紫简单荚膜染色、类脂粒染色、鞭毛染色、异染粒染色、芽孢染色、伴孢晶体染色和抗酸染色，并在显微镜下观察细胞大小、形态、排列方式及特殊构造。真菌参照《真菌鉴定手册》，载片培养48 h后显微镜观察菌丝及孢子形态特征，并观察菌落形态。

1.6.2 生理生化鉴定

利用bioMerieux公司全自动微生物分析仪（Vitek 2 Compact）及其配套的鉴定卡对上述选育出的菌株进行生理生化特性的鉴定。

1.7 所选菌株特性研究

1.7.1 菌株对石油烃类物质降解特性

将活化后的菌株转接至石油降解液体培养基中，28～35℃下180 r/min，摇瓶振荡培养72 h，利用超临界流体萃取（SF E）技术提取培养液中的原油，红外光谱法测定原油含量。降解率用菌株降解前后原油含量变化表示，计算平均降解率。

1.7.2 菌株对聚合物类物质的降解特性

将所选菌株分别接种至加有1 g/L聚丙烯酰胺的液体培养基中，以不添加聚丙烯酰胺的液体培养基为对照，28～35℃下180 r/min恒温培养72 h，淀粉-碘化镉法测定培养液中聚丙烯酰胺浓度，根据降解率确定菌株降解能力。

1.7.3 菌株的耐碱性研究

挑取活化好的菌株，分别接种于利用NaO H溶液调节p H值为7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10，10.5，11，11.5，12的液体培养基中，以不添加NaO H的培养基为对照，在28～35℃下180 r/min恒温培养72 h，菌株耐碱能力通过实验组和对照组活菌计数结果一致和培养液p H值变化的方式来确定。

1.7.4 菌株对温度的耐受性

将所选菌株活化后分别接种于各类菌液体培养基，置于10，20，30，40，50，60℃，180 r/min，培养48 h，根据活菌浓度确定复筛菌株对温度的耐受性。

2 结果与分析

2.1 采出水主要有害成分检测

对各油田采出水的主要有害成分如石油烃类、悬浮物含量以及p H值进行测定。

各油田采出水主要有害成分检测见表1。

表1 各油田采出水主要有害成分检测

由表1可知，同一油田采出水样品石油烃类含量、悬浮物含量以及p H值差异不大，不同油田的采出水主要污染物含量差异显著。各油田未经处理的采出水均没有达到行业S Y/T 5329—2012［9］，G B/T 18918—2002［10］采出水回注、排放控制标准。

2.2 初筛菌株

将经过富集培养、分离纯化以及通过采出水平板培养驯化的12株菌分别接入1 L采出水样品中培养，处理后采出水各项性能指标如表2所示。

表2 初筛菌株在油田采出水中培养各项性能指标分析

2.3 H e-Ne激光、紫外线复合诱变菌株复筛

初筛菌株的生长繁殖速率无法达到油田采出水微生物处理技术实际应用过程中对菌数的要求，通过应用H e-Ne激光、紫外线复合诱变技术可大幅度提高菌株在采出水中的各项生长性能指标。复合诱变后的菌株经复筛接入1 L采出水样品中各项指标变化如表3所示。

表3 复筛菌株在油田采出水中培养各项性能指标分析

初筛菌株通过复合诱变在利用油田采出水作为唯一营养源的条件下，菌株生长繁殖能力显著提升，菌体浓度最大可达n×109cfu/m L（n为自然数1～9），基本上达到菌株选育预期目的。

综合以上各项指标考虑，最终确定将菌株P w1、P w2、P w4、P w6和P w11应用于油田采出水的微生物处理。

2.4 菌株鉴定

2.4.1 形态学鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》和《真菌鉴定手册》形态学鉴定结果为：

①P w1菌落表面粗糙不透明，微白色或微黄色，无荚膜，周生鞭毛，能运动。（0.5～2.5）×（1.2～10）μm，革兰氏阳性，芽孢为椭圆或柱状，位于菌体中央或稍偏。

②P w2菌落白色或微黄色，边缘不规则，较黏稠，有光泽。（0.9～1.6）×（1.5～2.5）μm，革兰氏阴性，无芽孢，杆状，成对或成束排列，不运动，有荚膜。

③P w4菌落乳白色、呈圆形，凸起，边缘整齐。（0.8～1.0）×（2～3）μm，革兰氏阴性，菌体在放大400倍的显微观察下呈梭棒形。

④P w6经L B琼脂培养基培养，菌落为圆形、边缘不完整、不透明、表面光滑。（0.3～0.5）×（0.4～1）μm，革兰氏阴性，无芽孢、极生鞭毛。

⑤P w11血琼脂培养基上菌落中等大小呈暗灰色。12×20μm，菌体成圆形或椭圆形，芽殖，具有横隔的真菌丝或假菌丝，在菌丝顶端或中间有单个或成双的芽生孢子。

2.4.2 生理生化特征鉴定

利用全自动微生物分析仪检测菌株生理生化特性，菌株分析结果如表4所示。

表4 Vitek 2生理生化鉴定结果

菌株P w1与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的相似性为97%，菌株P w2与醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）的相似性为95%，菌株P w4与多食鞘氨醇杆菌（Sphingobacteriu m m ultivoru m）有91%相似性，菌株P w6与荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）有94%的相似性，菌株P w11与解脂假丝酵母（Candida tropicalis）的相似性为97%，均为非常好的鉴定。

2.5 菌株降解特性

2.5.1 菌株对石油烃类降解特性

根据已有资料报道及采出水样品分析结果，石油污染物是油井采出水污染主要有害成分［11］，因此，考察了所选菌株降解石油烃类的能力，结果如图1，所筛选菌株对石油烃类降解率最高为P w1可达78%，平均降解率近70%。

图1 菌株对石油烃类及聚丙烯酰胺的降解

2.5.2 菌株对聚合物类物质的降解实验

油田采出水中的悬浮成分和胶体构成极为复杂，经研究发现其中最难以降解，含量最高的成分是聚丙烯酰胺类物质［12-13］。因此通过考察菌株对聚丙烯酰胺的降解来衡量其对聚合物类物质的降解能力，结果如图1所示。菌株对聚丙烯酰胺均有一定降解能力且不同菌株差异显著，其中菌株P w6对聚丙烯酰胺降解率最高，可达57%。

2.5.3 菌株耐碱性试验

资料显示，各油田采出水p H值通常高达8～12。高碱性环境使得菌体内酶的活性降低，进而影响微生物细胞内的生物化学过程，甚至破坏微生物细胞，直接阻碍了微生物的生长繁殖。因此，考察了所选菌株对高碱性环境的耐受能力，结果如表5所示。

表5 菌株耐碱性实验

结果表明：选育出的5株菌均对高碱环境具有耐受能力，其中以P w1、P w6耐受能力最强，最高耐受p H值可达9.5。

2.5.4 菌株对温度的耐受性

油田采出水温度通常在40℃以上，一般微生物很难在这一温度范围内快速繁殖，因此选育耐高温菌株是微生物处理油井采出水的关键。菌株对温度的耐受性见图2。

图2 菌株对温度的耐受性

由图2可看出所筛选的五株菌中的细菌P w1、P w2、P w4、P w6最适生长温度均高于40℃，其中，真菌P w11在40℃时菌浓度高于7×109cfu/L，可以直接应用到油田采出水处理中。

3 讨 论

①芽孢杆菌属的某些细菌能够较好的降解转化和利用石油烃类、芳烃、酚类、有机氮化合物和沥青质等有机污染物，尤其对沥青质有较强的降解能力，同时可产生挥发性有机酸、脂肪酸、醚、酮、酯、生物表面活性剂等多种次级代谢产物［14］。

②不动杆菌属具有较强的降低原油表面张力和分解乳化的能力并能够降解利用长链烷烃、多环芳烃、酚类等。有报道自炼油厂污水中分离的醋酸钙不动杆菌能够以苯酚为生长所需的唯一碳源，具有高效降解苯酚、苯甲酸和邻苯二酚等的能力，在生物修复石油污染的环境中具有较大的应用前景［15］。

③鞘氨醇杆菌属的细菌多含有与多环芳烃（P A H s）降解有关的双加氧酶系统，能较好的利用P A H s，在多环芳烃的迁移转化乃至最终从环境中消失的过程中具有重要地位。其中多食鞘氨醇杆菌能够利用共代谢途径降解氯氰菊酯以及五氯酚、酰胺类除草剂等。其产生的生物絮凝剂和生物表面活性剂与人工合成的表活剂和絮凝剂相比效率更高、分解性更强，而且无毒无害，不会造成二次污染［16-17］。

④假单胞菌属细菌具有在各类恶劣环境中降解转化利用多达100种以上有机污染物的突出特点，并能分解利用一些特殊有机污染物，如石油烃类、甲醛、酚、汞化合物，乃至于六六六、D D T等有毒物质，是目前正被广泛应用于各类污染物污染环境修复的一类细菌［18］。

⑤假丝酵母属多数能够利用原油馏分中的正烷烃、正烯烃及环烷烃等碳氢化合物作为生长所需的碳源。研究指出解脂假丝酵母通过产生脂蛋白类乳化剂，将采出水中的烃类化合物乳化成油水充分混合的小液滴，可直接供菌体生长和代谢所利用。假丝酵母属多被用于重金属、农药、石油和酞酸脂污染的环境修复过程中［19］。

上述菌株均具有能在恶劣环境中生长繁殖和降解转化油田主要有害物质的能力。但是，由于单一微生物对于复合污染物的降解能力有限，未来将着重研究各类菌的互利生长、协同降解的培养工艺条件，来进一步提高油田采出水中复合污染物的降解效果。

4 结 论

①利用现代微生物学育种技术，通过初筛、复合诱变以及复筛选育了5株能够在油田采出水中快速大量生长繁殖并能高效降解油田采出水中主要有害污染物的微生物菌株。

②通过形态学、生理生化技术鉴定这5株菌分别为：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）、多食鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium multivorum）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、解脂假丝酵母（Candida tropicalis）。

③选育的5株菌对石油烃类、聚丙烯酰胺具有较强的降解能力，对高碱环境有一定的耐受能力，且最适生长温度在40℃左右，可直接应用于油田采出水处理。

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10.3969/j.issn.1005-3158.2015.05.008

1005-3158（2015）05-0026-05

2014-12-15）

（编辑 李娟）

陕西省重大科技创新项目，编号2009Z K C04-16。

杜茂林，西北大学生命科学学院微生物学专业，在读硕士研究生，主要从事油气田钻井废弃液以及含油污水的微生物无害化处置技术研究。通信地址：陕西省西安市碑林区太白北路229号，710069