汉防己甲素对伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑抗烟曲霉体外增效活性研究

李水秀，宋延君，石建萍，2，郭 慧，张玲玲，张 宏

2.广州医学院附属深圳沙井医院皮肤科，深圳 518000

近年来，侵袭性曲霉病仍然是免疫功能低下者发病和死亡的一个重要的原因，其主要由烟曲霉引起[1]。三唑类药物是治疗曲霉病的首选药物[2]，但随着其广泛、长期使用，烟曲霉对其的耐药率逐年上升[3－5]。因此，新型治疗方案的提出已成为迫切需要解决的问题。不同作用机制的抗真菌药物联合应用已成为新型治疗方案[6]。汉防己甲素（tetrandrine，TET）是从天然药用植物中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱，我们已证明其对氟康唑等 唑类抗真菌药物在体内外抗作为酵母菌代表的白念珠菌 有显著增效活性，其增效机制与抑制药物外排泵以及下调外排泵相关基因的表达有关[7－9]。本实验以烟曲霉作为深部感染的丝状真菌代表，进一步研究最大非细胞 毒性剂量的TET在体外对 伊曲康唑（itraconazole，ITR）、伏立康唑（voriconazole，VRC）和泊沙康唑（posaconazole，PCZ）抗烟曲霉的增效活性，为临床上以TET作为三唑类药物增效剂治疗烟曲霉病提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株和主要试剂

1.1.1 菌株 23株烟曲霉（AF5，AF7，AF8，AF9，AF10，AF13，AF17、AF18，AF19，AF20，AF21，AF23，AF24，AF26，AF27，AF29，AF30，AF31，AF38，AF46，0193，CBS，CMCC），前20株和来自广州军区广州总医院临床株，后3株由中国医学科学院皮肤病研究所惠赠。质控菌株选用美国临床和试验标准协会（CLSI）推荐的近平滑念珠菌 ATCC 22019。

1.1.2 主要试剂 ITR（梯希爱化成工业发展有限公司，批号I0732，纯度＞98.0%）。VRC（山东华禧药业有限公司，批号20110510，纯度＞98.5%）。PCZ（大连美仑生物技术有限公司，批号20130210，纯度＞99.0%）。TET（陕西慧科植物有限公司，批号20041226，纯度＞98.0% ）。RPMI 1640液体培养基（Gibco，USA，pH7.0）。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液制备 将受试菌株于PDA中37。C活化5～7天，用含有1%Tween 80的无菌生理盐水将烟曲霉孢子洗脱，并用RPMI 1640将其调整至工作浓度，菌液新鲜制备[10]。

1.2.2 TET对23株烟曲霉孢子相的最大非细胞毒性剂量测定 参照 M38－A方案的微量稀释法[11]。96孔板的第1～10孔内分别加入100μL倍比稀释的TET（终浓度为终浓度为0.625μg／mL～320μg／mL）和100μL受试菌液（终浓度为5×103CFU／mL）。阴性对照孔加入200μL的 RPMI 1640，正常生长对照孔加入100μL RPMI 1640和100μL受试菌液，混匀，37。C培养48h，以视觉法和OD值测定法判读结果。用RPMI 1640稀释后台盼蓝染色，利用细胞计数板计数，观察细胞形态并计算存活率。与正常生长对照孔比较，菌的存活率≥95%时认为该浓度为TET的最大非细胞毒性剂量。实验重复3次。

1.2.3 ITR、VRC和PCZ单独及联合TET抗烟曲霉活性测定 参照 M38－A方案的微量稀释法[11]。分 组：ITR／VRC／PCZ 组、ITR／VRC／PCZ 联 合TET组。ITR／VRC／PCZ组分别加入100μL倍比稀释的ITR／VRC／PCZ（终浓度为0.0625μg／mL～64μg／mL）和100μL受试菌液（终浓度为5×103CFU／mL）。ITR／VRC／PCZ联合 TET 组分别加入50μL的ITR／VRC／PCZ（终浓度为0.0625μg／mL～64μg／mL）、50μL的TET（终浓度为80μg／mL）和100μL受试菌液（终浓度为5×103CFU／mL）。阴性对照孔加入200μL的RPMI 1640。正常生长对照孔加入100μL RPMI 1640和100μL受试菌液，混匀，37。C培养48h，以视觉法和OD值测定法判读结果。实验重复3次。

1.2.4 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件的配对t检验进行统计分析。

2 结 果

2.1 质控标准 每次实验所测得的质控菌株ATCC 22019对ITR、VRC和PCZ的MIC值分别为0.125μg／mL～0.5μg／mL、0.0625μg／mL～0.125μg／mL和0.0625μg／mL～0.125μg／mL，均在CLSI M38－A规定的范围内，说明每次实验操作准确可靠。

2.2 TET对烟曲霉的非细胞毒性剂量 TET＞80μg／mL时，对烟曲霉有抑制作用，且菌的存活率随TET浓度的增高而降低。TET≤80μg／mL时，菌的存活率＞95%，视觉法观察其浊度与正常生长对照孔无差异。故选80μg／mL为TET在体外对ITR、VRC和PCZ抗烟曲霉增效活性的最大非细胞毒性剂量。

2.3 ITR、VRC和PCZ单独及联合TET抗烟曲霉活性 ITR、VRC和PCZ单独及联合TET对23株烟曲霉的MIC值见表1。ITR单独及联合TET的MIC值范围分别为 0.5μg／mL～32μg／mL 和0.0 625μg／mL～4μg／mL，差异有统计学意义（P＜0.05）；VRC单独及联合TET的MIC值范围分别为0.25μg／mL～2μg／mL和0.03125μg／mL～0.25μg／mL，差异有统计学意义（P＜0.05）；PCZ单独及联合TET的MIC值范围分别为0.125μg／mL～1μg／mL 和0.03125μg／mL～0.25μg／mL，差异有统计学意义（P＜0.05）。ITR、VRC和PCZ联合TET时，其MIC终点清晰，“拖尾现象”消失。说明最大非细胞毒性剂量的TET在体外对ITR、VRC和PCZ抗烟曲霉有增效活性。

表1 ITR、VRC和PCZ单独及联合TET对23株烟曲霉的MICsTab.1 MICs of ITR，VRC and PCZ alone and in combination with TET

3 讨 论

我们前期实验已证明TET对氟康唑等唑类抗真菌药物在体外及动物体内抗作为酵母菌代表的白念珠菌 有显著增效活性，其增效机制与其通过影响ATP的产生和转换过程而抑制药物外排泵对药物的外排功能和下调外排泵相关基因MDR1、FLU1、CDR1、CDR2的表达有关[7－9，12]。但 TET 对唑类药物抗深部感染的丝状真菌 是否有增效活性尚未知。所以，本研究以烟曲霉临床株作为深部感染的丝状真菌代表，研究最大非细胞毒性剂量的TET对ITR、VRC和PCZ的体外增效活性。

本实验发现：在体外，联合TET 80μg／mL后，ITR对烟曲霉MIC值可降低2～5个稀释度；VTC对烟曲霉MIC值可降低1～4个稀释度；PCZ对烟曲霉MIC值可降低1～4个稀释度。可见在体外TET对ITR、VRC和PCZ抗烟曲霉有增效活性。

TET对ITR、VRC和PCZ抗烟曲霉的增效机制尚未知。但我们前期实验证明的TET对唑类药物抗白色念珠菌的增效机制与其抑制药物外排泵和下调外排泵相关基因表达有关[9]。Morschhauser[13]报道，外排泵功能以及其编码基因的高表达在导致烟曲霉对唑类抗真菌药物耐药过程中起了重要作用。由此推测TET对ITR、VRC和PCZ抗烟曲霉的增效机制也可能是通过影响外排泵功能及下调外排泵相关基因的表达而起作用。下一步将从基因表达、蛋白表达等方面进行研究。

目前，测定两种或以上药物体外联合作用的药敏实验多采用美国临床和实验室标准协会（CLSI）推荐的棋盘式微量液基稀释法，其具有客观、准确地测定和评价两种或以上药物联合作用是否表现为协同作用的优点。但是，棋盘法不能测定非细胞毒性剂量的药物A对药物B抗真菌是否有增效活性，而微量液基稀释法却可以测定药物A对药物B抗真菌的增效活性。于是，本研究采用CLSI推荐的微量液基稀释法证明了最大非细胞毒性剂量的TET对ITR、VRC和PCZ在体外 抗烟曲霉有显著增效活性。

TET来源于天然药用植物，有着作用温和、来源广泛、不良反应少、良好的抗真菌药物增效机制等特点。我们发现，治疗剂量的TET在体外和动物体内单独应用时无抗白色念珠菌等真菌活性，但联合唑类药物应用时能显著提高唑类药物抗白色念珠菌等真菌活性。由于该药安全、有效且主要作用机制明确，结合本研究和课题组前期研究，因此，完全可能成为一种有临床价值的抗真菌药物增效剂。

（衷心感谢中国科学院皮肤病研究所刘维达教授和沈永年老师惠赠烟曲霉0193、CBS、CMCC和近平滑念珠菌ATCC 22019，广州军区广州总医院王露霞医生惠赠烟曲霉临床菌株。）

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