贵州省一例人感染猪链球菌病例的病原学检测与分析

马 青，李世军，刘 英，田克诚，唐光鹏，王定明

人感染猪链球菌病是由猪链球菌（Streptococcussuis）感染人而引起的人兽共患病[1]，猪链球菌（S.suis）目前已知有35个血清型，其中猪链球菌2型（S.suisserotype 2）在世界上流行最广，致病性最强，同时能引起人的感染，是一种重要的人兽共患病病原[2]。近年来国内已发生多起人感染猪链球菌病疫情，1998年我国江苏省猪链球菌病暴发，造成数万头生猪死亡，并导致几十例人感染猪链球菌病，死亡14例[3]；2005年四川省报告人感染猪链球菌病204例，死亡38例，为国内外迄今为止见于报道的最大规模人感染猪链球菌病疫情[4]；人感染猪链球菌病散发病例在其它省份也时有发生[1，5－7]。贵州省2006年于罗甸县一例病例中分离出猪链球菌2型菌株[8]。本研究对2013年贵州省1起人感染猪链球菌疑似疫情进行病原学调查与分析，了解病原学特征，为疫情的确定及患者的诊断和治疗提供病原学依据。

1 材料和方法

1.1 病例信息 患者邰某某，男，42岁，来自剑河县观么乡观么村，该村位于剑河县观么乡政府所在地，距离剑河县人民政府所在地65km。观么村有4个村民小组，186户，928人，均为苗族。家畜为圈养，无放养习惯。患者曾于2013年2月4日宰杀自家年猪，当日又到本村村民费某某家宰杀生猪1头，2月5日又到该村另一村民钱某某家宰杀生猪，在分割肉时不小心划伤左手指，于2013年2月15日发病，临床症状主要有寒战、发热和嗜睡状，病程进展迅速，脑膜炎症状明显，经贵阳医学院第二附属医院临床诊断为人感染猪链球菌病疑似病例。

1.2 标本 经贵阳医学院第二附属医院临床诊断的1例剑河县人感染猪链球菌病疑似病例的血液来源菌株。

1.3 实验试剂 猪链球菌2型单克隆抗体由中国疾病预防控制中心提供，API 20Strep生化鉴定条购自法国生物梅里埃公司，PCR试剂为Takara公司生产商品试剂盒。

1.4 菌落观查与染色镜检 将可疑菌株接种于血琼脂平板置37。C二氧化碳培养箱培养24h，观察菌落特征，挑取单个可疑菌落进行革兰染色后镜检。

1.5 血清分型试验 挑取菌落做玻片凝集试验，同时设生理盐水对照。

1.6 生化鉴定 挑取单个菌落转种羊血琼脂平板，于37。C二氧化碳培养箱培养24h。按照API 20 Strep试剂盒说明书操作根据生化反应结果进行编码，对照API 20Strep生化系统编码判定结果[9]。

1.7 猪链球菌靶基因检测 按照中国疾病预防控制中心提供的引物，见表1和PCR方法检测猪链球菌种特异的16SrRNA基因、猪链球菌2型cps2J、mrp、sly和ef。反应体系（50μL）为上下游引物各2 μL、模板2μL、Taqmix 25μL、去离子水19μL。mrp、cps2J和16SrRNA基因的扩增参数为94。C预变性5min；94。C30s，56。C30s，72。C30s，30个循环，最后72。C延伸5min。Sly基因扩增参数为94。C预变性5min；94。C60s，51。C60s，72。C90s，30个循环，最后72。C延伸5min。Ef基因扩增参数为94。C预变性5min；94。C30s，56。C30s，72。C30s，30个循环，最后72。C延伸5min。

表1 猪链球菌基因检测引物Tab.1 Primers of Streptococcus suis

2 结 果

2.1 菌落特征与镜检结果 可疑菌株在羊血琼脂平板上于37。C二氧化碳培养箱培养24h后出现直经约1mm、表面突起、光滑湿润、圆整、半透明略带灰白色、呈α溶血的菌落，革兰染色后油镜下呈成对或短链状革兰氏阳性球菌。

2.2 血清分型结果 可疑菌株菌落与猪链球菌2型单克隆抗体发生凝集反应，生理盐水对照未发生凝集反应。

2.3 生化鉴定结果 血液中分离菌株的API 20 Strep生化试验结果编码为4640453，对照编码表结果判定为猪链球菌II型，API 20Strep生化结果详见表2。

2.4 PCR检测结果 PCR检测结果显示猪链球菌种特异的16SrRNA基因、猪链球菌2型特有的毒力基因cps2J及毒力基因mrp、sly和ef均出现预期大小的DNA扩增条带，见图1。

3 讨 论

猪链球菌是一种人兽共患病原菌，呈世界性分布。猪链球菌共有35个血清型，尽管所有血清型都能致病，但是能感染人的致病血清型主要包括1／2、1、2、7、9和14型6种类型。其中血清2型广泛存在于猪的呼吸道中，是从病猪和患者中分离最多的一种致病菌，也是我国的主要致病菌，引起1998年江苏和2005年四川人感染猪链球菌病疫情大暴发的病原也是血清2型菌株[4－5]。猪链球菌2型具有很强的侵袭能力，并产生致病性很强的外毒素，引起感染者发生严重的不可逆的休克及DIC，最后发生多器官功能衰竭而死亡[2]。

表2 疑似猪链球菌菌株生化鉴定结果Tab.2 Biochemical identification results of suspected Streptococcus suis

图1 疑似猪链球菌菌株PCR检测结果Fig.1 Electrophoretic bands of suspected Streptococcus suis

API 20Strep生化条与常规生化试验相比，操作方便且可直接鉴定到型，冯泽惠[9]等应用此方法对24株链球菌进行了种的鉴定，鉴定符合率达91.67%。因此API 20Strep生化条可作为猪链球菌的一种简便可靠的方法。本研究应用API 20 Strep生化系统对疑似菌株进行鉴定，结果为猪链球菌2型，并与血清凝集试验结果相符。

猪链球菌16SrRNA基因片段具有种特异性，cps2J基因为猪链球菌2型的特异性基因，可以作为鉴定猪链球菌2型的靶基因，因此本研究选择16SrRNA和cps2J基因对疑似菌株进行鉴定，其结果均为阳性，提示本研究中的疑似菌株为猪链球菌2型菌株。据资料报道[10]，并不是所有猪链球菌2型都对人致病，猪链球菌2型存在着强致病力、弱致病力以及无致病力菌株。猪链球菌2型致病力取决于它的毒力因子，其中较为重要的主要包括荚膜多糖（cps）、溶菌酶释放蛋白（mrp）、细胞外因子（ef）、溶血素（sly）以及多种具有毒性作用的蛋白。曾巧英等[11]研究证明mrp可单独作为猪链球菌2型的毒力因子。由于mrp和ef在强毒株中检出率很高，在非致病菌株中检出率很低，因而mrp和ef常被认为是猪链球菌2型高致病性的标志[12]。为了证实本研究中的菌株为有致病力的菌株，本研究以cps2J、mrp、sly和ef为靶基因对疑似菌株进行了PCR鉴定，其结果均为阳性，表明本次分离菌株为猪链球菌2型强毒株。

流行病学调查资料显示，本研究中患者曾于2013年2月4日宰杀自家年猪，当日又到本村村民费某某家宰杀生猪1头，2月5日又到该村另一村民钱某某家宰杀生猪，在分割肉时不小心划伤左手指，于2月15日晚出现头痛、呕吐、畏寒发热等症状。结合本研究病原学调查结果，可以判定该起疫情为一起人感染猪链球菌病疫情，患者感染途径为接触被猪链球菌污染的生猪肉通过伤口而感染。

值得关注的是，患者家及帮忙宰杀猪的两户村民家中喂养的生猪中均无病死现象，患者此次宰杀生猪之前也未曾接触过病死猪，也未到过外地。说明表观健康猪群有携带致病性猪链球菌2型的可能性，应在加强表观健康猪群的猪链球菌监测的同时，对从事生猪屠宰、加工、销售等从业人员或其他相关人员采取严格的个人防护措施以防止猪链球菌感染。

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