猪源假结核耶尔森氏菌的分离与鉴定

石於友，陈汝琎，曾顺玉，刘 宁，宋 聪，李美荃，李华春，赵德宏，姚 俊

（1. 云南省巍山县动物疫病预防与控制中心，巍山 672400；2. 云南省富宁县动物疫病预防与控制中心，富宁663400；3. 云南省双江县畜牧兽医技术推广中心，双江 677300；4. 云南农业大学动物科学技术学院，昆明

650201；5. 云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，昆明 650224）

猪源假结核耶尔森氏菌的分离与鉴定

石於友1，陈汝琎2，曾顺玉3，刘 宁4，宋 聪4，李美荃4，李华春5，赵德宏5，姚 俊5

（1. 云南省巍山县动物疫病预防与控制中心，巍山 672400；2. 云南省富宁县动物疫病预防与控制中心，富宁663400；3. 云南省双江县畜牧兽医技术推广中心，双江 677300；4. 云南农业大学动物科学技术学院，昆明

650201；5. 云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，昆明 650224）

2014年8月26日云南省富宁县某生猪散养户饲养的中大猪群发生疑似猪丹毒疫情，送检病死猪组织样品经猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒II型的Real-time PCR检测，结果均为阴性。同时进行病原体的分离培养，从淋巴结中分离获得1株革兰氏染色阴性杆菌，呈两极浓染，经昆明小白鼠致病性实验、本动物回归实验、细菌生化实验鉴定，该病原体为假结核耶尔森氏菌。药敏实验结果显示该菌株对氧氟沙星、庆大霉素、诺氟沙星、头孢噻肟高度敏感，对呋喃唑酮、头孢曲松钠、四环素中度敏感，对氨苄青霉素低度敏感，对青霉素耐药。

假结核耶尔森氏菌；分离；鉴定；猪

假结核耶尔森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）属于肠杆菌科、耶尔森菌属，是该属三种致病性菌之一，另两种为鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）与小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）［1］。耶尔森菌属细菌为革兰氏阴性直杆菌或球杆菌，菌体大小（0.5～0.8）μm×（1～3）μm，散在排列，菌体染色呈现两极浓染现象，无芽孢，周生鞭毛，无荚膜［1］。在营养琼脂培养基上25℃培养24 h后形成的菌落直径约为0.3～0.6 mm，呈圆形、凸起、光滑、边缘整齐、无色透明、无特殊气味，48 h后可扩大到0.8～1.0 mm［1］。耶尔森氏菌在麦康凯及SS培养基上几乎不生长［1］。假结核耶尔森氏菌是一种人兽共患的肠道病原菌，流行特点与小肠结肠炎耶尔森菌很相似，但假结核耶尔森氏菌能够感染的动物种类更广泛，感染率则低于小肠结肠炎耶尔森菌［1］。人感染假结核耶尔森氏菌后，临床症状偏于淋巴结感染和败血症，也可形成回肠盲端炎［2］。假结核耶尔森氏菌感染可引起发热、结节性红斑、结膜炎、关节炎、肠系膜淋巴结炎、冠状动脉瘤、急性肾炎等。国内仅见败血症性肺炎、肠炎及肠系膜淋巴结炎报道［3］。假结核耶尔森菌感染母牛发生菌血症时，可引发胎儿感染，从而导致流产［4-7］。

2014年8月26日，云南省富宁县木央镇睦伦村委会生猪散养户饲养生猪发生疫情，发病猪精神萎顿，高烧不退，食欲废绝并伴有呕吐，结膜充血，粪便干硬并附有粘液，发病仔猪病程后期下痢。发病猪耳、颈、背部皮肤潮红、发紫，临死前腋下、股内、腹内有不规则暗红色斑块，指压褪色而后又融合在一起（图1），常于发病后3～4 d内死亡，病死率80%左右，未死亡的发病猪转为疹块型或慢性型，临床初步诊断为疑似猪丹毒。对病死猪进行解剖，经病原菌分离培养、昆明小白鼠致病性实验、本动物回归实验及细菌生化实验等，最终鉴定为假结核耶尔森氏菌。根据药敏实验结果指导临床用药，迅速控制了疫情的蔓延。本文对假结核耶尔森氏菌引起猪群发病的报道在国内尚属首次。

图1 发病及病死猪皮肤表面可见暗红色斑块（箭头所示）Fig.1 Dark red patches interspersed on skin surface of infected pigs and dead pigs （indicated by the arrows）

1 材料与方法

1.1 病死猪解剖及样品采集 病死猪解剖后可见颌下淋巴结肿大，肝脏、肾脏轻微肿大，肝脏表面有散在出血点，肾脏表面有出血斑，喉头粘膜面可见出血点。采集股沟淋巴结、颌下淋巴结、肠系膜淋巴结、脾脏、肺脏和肝脏组织，进行Real-time PCR检测，同时进行病原菌的分离培养。

1.2 主要试剂、菌种、培养基及仪器 营养琼脂培养基、麦康凯培养基、显色指示剂购自杭州滨和微生物试剂有限公司；新生犊牛血清购自美国生命技术有限公司（Life Technologies）；革兰氏染液、肠杆菌科细菌生化编码鉴定管GYZ-15e、常用新药敏纸片及细菌培养基购自杭州天和微生物试剂有限公司；假结核耶尔森氏菌ATCC标准菌株由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室保存；病毒DNA提取试剂盒（Viral DNA Kit）、病毒RNA提取试剂盒（Viral RNA Kit）购自美国OMEGA生物技术有限公司；细菌基因组DNA抽提试剂盒、荧光定量qPCR及qRT-PCR试剂盒、2×Plus Taq酶、DNA Marker DL 2000均购自天根生物技术（北京）有限公司；一步法RT-PCR试剂盒（One Step RT-PCR Kit）购自大连宝生物（TaKaRa）生物技术有限公司；普通光学显微镜为OLYMPUS CX31显微镜；CO2培养箱购自THERMO SCIENTIFIC公司；生物安全柜为ESCO CLASS II TYPE A2；PCR 仪 Gene Amp PCR System 9700、实时荧光 PCR 仪7500 Fast Realtime PCR System、梯度PCR仪均购自 ABI（Applied Biosystems Inc.）公司。

1.3 引物设计 根据NCBI GenBank假结核耶尔森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）ATCC 6904株16S rRNA基因参考序列（Accession：NZ_ CP008943.1），设计了1对引物（P-382-F：5'-GGAGTTAGCCGGTGCTTCTT-3'；P-382-R：5'-TGCCTGATGGAGGGGGATAA-3'），PCR产物扩增长度为382 bp。

1.4 实验动物 昆明成年小白鼠25只购自昆明医科大学实验动物中心。70日龄DLY三元杂仔猪5头购自云南省畜牧兽医科学院实验猪场。

1.5 猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株及美洲株、猪瘟病毒、伪狂犬野毒株、猪圆环病毒II型Real-time PCR检测 运用云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株及美洲株、猪瘟病毒、伪狂犬野毒株、猪圆环病毒II型实时荧光定量PCR检测方法进行检测。

1.6 细菌分离鉴定 将样品划线接种于血清琼脂、营养琼脂及麦康凯琼脂平板后，置于37℃温箱培养24～48 h，取少许菌落染色镜检观察形态。将细菌纯化后穿刺接种于TSI试管斜面及肠杆菌科细菌生化编码鉴定管后，置于37℃培养24～48 h后加显色剂判读结果。

1.7 小白鼠致病性实验 将纯化后的细菌混悬于无菌生理盐水中，经菌数测定后稀释为1.5×108个细菌/ mL浓度，每只小白鼠腹腔接种0.1 mL剂量，共接种20只作为实验组；同时设立5只阴性对照，腹腔接种同等剂量无菌生理盐水。接种后观察、记录发病及死亡情况，解剖死亡小白鼠观察病理变化并无菌采集心血及肝脏回收分离病原菌。

1.8 本动物回归实验 将纯化后的细菌混悬于无菌生理盐水中，经菌数测定后稀释为1.5×108个细菌/mL浓度，每只仔猪颈部肌肉接种1mL剂量，共接种4只作为实验组；同时设立1只阴性对照，颈部肌肉接种同等剂量无菌生理盐水。接种后观察、记录发病及死亡情况，解剖病死仔猪观察病理变化并无菌采集心血及肝脏回收分离病原菌。

1.9 基因组离子鉴定 应用细菌基因组DNA抽提试剂盒抽提分离菌株的基因组DNA进行PCR扩增，并切胶回收测序及序列分析。

1.10 药敏实验 将纯化后的细菌均匀涂布于营养琼脂平板上，贴上药敏试纸于37℃培养24 h后取出观察结果并测定抑菌圈直径。

2 结果

2.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株及美洲株、猪瘟病毒野毒株、伪狂犬野毒株、猪圆环病毒II型Realtime PCR检测结果 送检样品经云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株及美洲株、猪瘟病毒野毒株、伪狂犬野毒株、猪圆环病毒II型Real-time PCR法检测，结果全为阴性。

2.2 细菌分离鉴定结果 送检组织样品经接种环无菌采集样品后，划线接种于血清琼脂、普通营养琼脂及麦康凯琼脂平板，37℃培养过夜，在血清琼脂及普通营养琼脂平板上形成圆形、凸起、光滑、边缘整齐、无色透明、无特殊气味的菌落（见图2），在麦康凯琼脂平板不生长。经革兰氏染色镜检呈革兰氏阴性直杆菌，呈两极浓染现象，散在排列，无芽孢，无荚膜（见图3）。生化实验结果为ONPG、尿素阳性，靛基质、VP、苯丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、枸橼酸盐、硫化氢、磷酶、戊唐、棉籽糖、山梨醇、侧金盏花醇、二磷酶阴性，生化鉴定为假结核耶尔森氏菌。

2.3 小白鼠致病性实验 接种细菌的20只昆明小白鼠精神萎顿，饮食欲废绝，打堆，全部于接种后24～53 h内死亡，解剖可见肺脏、肝脏、脾脏、肾脏肿大、淤血或出血，并从死亡小白鼠肝脏及心血回收到细菌。5只阴性对照昆明小白鼠无任何临床症状。

图2 普通营养琼脂平板上形成的菌落Fig.2 Bacterial colonies on the surface of general nutrition agar plate

图3 革兰氏染色镜检结果Fig.3 The results of Gram staining

2.4 本动物回归实验 4只70日龄DLY三元杂仔猪接种细菌分离株18 h后表现出精神沉郁，饮食欲废绝，打堆，部分猪发抖，呕吐，粪便干硬，附有粘液，出现腹泻，体温升至40℃～42℃，体表及耳部可见不规则暗红色淤血斑，指压后可褪色（图4）。接种后3～5 d内死亡3头，1头耐过。1头阴性对照仔猪无任何临床症状。病死猪解剖后可见肺脏淤血、出血，脾脏肿大、肾脏包膜剥离表面可见有淤血斑，肠系膜淋巴结肿大、胃肠粘膜脱落，其余内脏器官未见异常。

图4 实验组仔猪体表及耳部可见不规则红色斑块Fig.4 Irregular dark red patches scattered in the skin of experimental group piglets

2.5 分子鉴定结果 PCR扩增出大约382 bp的目的片段（图5），并将测定序列在NCBI GenBank中进行Blast，测定出的序列与假结核耶尔森菌（Yersinia pseudotuberculosis）16S rRNA基因参考序列同源性高达99%（图略）。

图5 分离菌株基因组的PCR扩增结果Fig.5 PCR results of genome from bacteria isolates

2.6 药敏实验结果 药敏实验结果显示，分离细菌对氧氟沙星、庆大霉素、诺氟沙星、头孢噻肟高度敏感，对呋喃唑酮、头孢曲松钠、四环素中度敏感，对氨苄青霉素低度敏感，对青霉素耐药。

3 讨论

日本对假结核耶尔森氏菌的研究历史悠久，1913年采泽氏曾对感染本菌而死于败血症的男人进行细菌的分离鉴定，以及动物实验和病理学研究［4］。

图6 分离菌株药敏试验结果Fig.6 The results of drug sensitive test for bacteria isolates

1973年坪仓等［4］从摘除的阑尾分离出该菌。目前人类假结核耶尔森氏菌病不仅是小儿科的重要疾病，在日本还发生过暴发流行［8］。我国对人的假结核耶尔森氏菌病报道较多，但对动物的假结核耶尔森氏菌病报道并不多见，仅见有犊牛、林麝、安哥拉兔及松鼠猴感染发病的报道［8，9］，目前该菌引起猪致病在国内尚未见报道［10-13］。在日本，猪是假结核耶尔森菌的主要宿主动物，欧洲则以野兔和鸟为主，而国内假结核耶尔森菌的自然宿主动物无从知晓。由于猪、狗、猫与人的日常生活接触机会较多，因此应该密切注意并防范这些动物成为人感染假结核耶尔森氏菌的传染源。动物主要是通过食入被污染的食物或饲料感染假结核耶尔森氏菌，本文报道的猪假结核耶尔森氏菌病的发生是通过食入受野生动物粪尿污染的饮水或饲料感染［14］，还是通过接触发病猪或食入受携带病原菌猪排泄粪尿污染的饲草或饮水所致，其原因有待进一步调查。目前假结核耶尔森菌在日本至少存在有12种血清型，健康带菌猪群主要以3型为主，另外4b型也是人及动物检出率较高的血清型［8］，而我国的人及动物优势血清型仍然未知，有待于进一步开展血清学调查研究。本文报道的猪感染假结核耶尔森氏菌病例中，发病猪体温升高，病死猪体表出现不规则的暗红色淤血斑块，指压褪色后可融合在一起，与亚急性型（疹块型）猪丹毒极其相似，因此临床上很容易做出误诊，应该辅助于实验室诊断才能做出确诊。传统的细菌分离鉴定方法耗时、费力，为了能在最短时间内对该病进行确诊，可针对细菌16S rRNA基因的保守区域设计合成通用引物，进行PCR扩增，对PCR扩增产物切胶回收后测序，在NCBI GenBank进行序列比对分析后，即可做出确诊。本病例中，通过选用假结核耶尔森氏菌高敏的抗菌药物氧氟沙星、庆大霉素等对发病猪进行治疗，获得了良好的治疗效果。

［1］陈东科， 孙长贵. 实用临床微生物学检验与图谱［M］. 2版.北京∶ 人民卫生出版社， 2011， 356-364.

［2］Voskressenskaya E， Leclercq A， Tseneva G， et al. Evaluation of ribotyping as a tool for molecular typing of Yersinia pseudotuberculosis strains of worldwide origin［J］. J Clin Microbiol， 2005， 43（12）∶ 6155-6160.

［9］Vincent P， Leclercq A， Martin L， et al. 2004-2005年法国暴发人假结核耶尔森病［J］. 中国人兽共患病学报， 2008，（9）∶ 11-19.

［8］坪仓.假结核耶尔森氏菌在日本的分布及人类假结核病的流行概况［J］. 谢奉璋， 译. 田守民， 校. 感染症学杂志（日文）， 1987， 61（7）∶ 737-745.

［10］汪远根， 杨德宵， 陶全功， 等. 安哥拉兔假结核耶尔森氏菌病诊断与预防［J］. 疫病防治， 2007， （7）∶ 22， 24.

［11］乐牧. 犊牛中发现伪结核耶尔森氏菌性肠炎［J］. 青海畜牧兽医杂志， 1991， （6）∶ 46.

［12］周紫峣， 周潇潇， 彭广能， 等. 松鼠猴感染假结核耶尔森菌的诊治［J］. 兽类学报， 2014， 34（2）∶ 181-187.

［13］解冰冰， 彭家兰， 钟志军， 等. 某林麝场林麝感染假结核耶尔森菌的诊治［J］. 四川动物， 2014， 33（3）∶ 419-424， 433.

［14］李凡， 谷鸿喜， 黄敏. 医学微生物学［M］. 5版. 北京∶ 高等教育出版社， 2003∶ 142-145.

［3］Abe， Onimaru M， Matsumoto S， et al. Clinical role for a super antigen in Yersinia pseudotuberculosis infection［J］. J Clin Invest， 1997， 99∶ 1823-1830.

［4］于东祥. 假结核耶尔森杆菌败血症性肺炎1例［J］. 中华全科医师杂志， 2005， 4（1）∶ 58.

［5］黄俊军， 伊力哈木. 假结核耶尔森菌肠炎误诊为急性阑尾炎［J］. 临床误诊误治， 2002， 15（3）∶ 236.

［6］刘莉， 刘都礼， 姜勇， 等. 假结核耶尔森菌肠系膜淋巴结炎［J］. 华西医学， 2007， 22（3）∶ 542-543.

［7］Andrews A H， Blowey R W， Boyd H， et al.牛病学—疾病与管理 ［M］. 2版. 韩博， 苏敬良， 吴培福， 王九峰， 译. 北京∶ 中国农业大学出版社， 2006∶ 187-190.

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS FROM SWINE IN CHINA

SHI Yu-you1， CHEN Ru-jin2， ZENG Shun-yu3， LIU-Ning4， SONG-Cong4， LI Mei-quan4， LI Hua-chun5，ZHAO De-hong5， YAO Jun5
（1. Weishan Center for Prevention and Control of Animal Disease， Yunnan Province， Weishan 672400， China； 2. Funing Center for Prevention and Control of Animal Disease， Yunnan Province， Funing 663400， China； 3. Shuangjiang Center for Animal Husbandry and Veterinary Technology Promotion， Yunnan Province， Shuangjiang 677300， China； 4. College of Animal Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201，China； 5.Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Diseases Laboratory， Yunnan Animal Science and Veterinary Institute， Kunming 650224， China）

On August 26， 2014 in Funing County，Yunnan Province， many pigs suddenly died for unknown reason. The dead pigs were necropsied and tissue samples were collected for detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV），Classical swine fever virus （CSFV）， Pseudorabies virus （PRV） and Porcine circovirus type II， （PCV II） as well as bacterial isolation and identifi cation. The results of the Real-time PCR for PRRSV， CSFV， PRV and PCV-II were all negative. Instead， one bacterial strain was obtained from mesenteric lymph node. The bacterial isolate was gram-negative， straight bacillus and strong polar dyeing. Furthermore，the bacterial isolate was examined for its biochemical reactions and pathogenecity in mice and pigs and fi nally identifi ed as Yersinia pseudotuberculosis. The drug susceptibility test showed that the bacterial isolated was highly susceptible to Ofloxacin， Gentamicin，Norfl oxacin and Cefotaxime， moderately susceptible to Furazolidone， Ceftriaxone sodium and Tetracycline， less susceptible to Ampicillin and resistant to Penicillin.

Yersinia pseudotuberculosis； isolation； identifi cation； pig

S852.61

A

1674-6422（2015）05-0036-05

2015-07-08

云南省科技厅科技专项（2012ZA017）

石於友，男，兽医师，主要从事兽医临床及实验室诊断检测工作

姚俊，E-mail：810535839@qq.com