银杏叶中芦丁含量快速定量数学模型的建立

董 毅， 朱绍华， 张 莹*， 张 帆,3， 黄志强， 陈 波

(1.湖南省检验检疫科学技术研究院， 湖南 长沙 410004； 2.湖南师范大学化学生物学及中药分析教育部重点实验室， 湖南 长沙 410004； 3.长沙环境保护职业技术学院， 湖南 长沙 410004)

银杏叶中芦丁含量快速定量数学模型的建立

董 毅1,2， 朱绍华1， 张 莹1*， 张 帆1,3， 黄志强1， 陈 波2

(1.湖南省检验检疫科学技术研究院， 湖南 长沙 410004； 2.湖南师范大学化学生物学及中药分析教育部重点实验室， 湖南 长沙 410004； 3.长沙环境保护职业技术学院， 湖南 长沙 410004)

利用傅里叶变换近红外透射光谱收集了19批不同产地银杏叶样品的近红外光谱图，运用OPUS 6.5分析软件对其进行一阶导数和多元散射校正预处理。在7500～6099cm-1和5450～4249cm-1范围内，因子数选择7，采用偏最小二乘法(PLS)对芦丁的含量进行了快速定量测定，根据超高效液相色谱-串联质谱测定的芦丁含量结果，建立了银杏叶中芦丁含量的定量数学模型。近红外模型预测结果与色谱检测结果相吻合，模型均方差为0.194，预测集的平均回收率为98.40%。本方法快速、简便，可应用于银杏叶药材的质量控制和大批量产品的检测。

近红外光谱； 银杏叶； 芦丁； 定量模型

银杏叶是我国特产的银杏科银杏属植物银杏(GinkgobilobaL.)，又称之为公孙树的干燥叶[1-2]，其主要活性成分总黄酮类化合物以及二萜内酯凭借良好的清除自由基、抗衰老、调节血脂和血糖等药理功效广泛地应用于记忆障碍、糖尿病、外周血管疾病、脑功能障碍等疾病的临床治疗[3-7]。

现行的检测标准对银杏叶提取物质量的控制主要通过测定水解后产生的总黄酮醇苷来实现，芦丁、槲皮素等水解前的重要化学成分的质量控制却难以实现，往往只能通过人为的添加来达到现行标准的要求，以次充好，从而影响了中成药的成品质量[8-9]。目前银杏叶提取物中活性成分总黄酮的质量控制的分析方法主要有紫外分光光度计法[10]、高效液相色谱法[11-12]等，这些传统检测方法进行测定前通常需要对银杏叶样品进行繁冗的前处理，不仅费时，检测成本也较高，满足不了生产过程检验中简便、快速的需求。近年来，近红外光谱技术作为一种快速分析技术在产品质量控制过程中广泛受到关注，该技术具有无需复杂样品前处理步骤、操作简便、分析速度快、成本低廉、无污染等优点，在银杏叶等中药材生产过程中质量控制的应用前景十分广阔[13-16]。

我们以全国19个不同产地的银杏叶为研究对象，在采用超高效液相色谱-串联质谱法测定银杏叶中芦丁含量的基础上，应用近红外光谱技术，结合OPUS 6.5分析软件，利用近红外光谱与色谱检测值，建立了银杏叶中芦丁含量的快速定量数学模型。

1 仪器、材料与试剂

LCMS — 8040超高效液相色谱 — 三重四级杆质谱联用仪，ESI源(日本岛津公司) ；MPA傅里叶变换近红外光谱仪，配置样品旋转台；SB — 5200DT超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)； UNIVERSAL320 高速冷冻离心机(德国Hettich公司)；MILLI — Q去离子水系统(美国Millipore公司)。

芦丁标准品(批号: 0080 — 9705供含量测定用)，购于中国药品生物制品鉴定所；乙酸、乙腈为色谱纯；乙醇为分析纯。

19批银杏叶为2014年4月至2014年9月期间收集于湖南、湖北、广西、陕西等地(具体产地见表1)，经粉粹后，过100目筛，备用。

2 超高效液相色谱法测定银杏叶中的芦丁含量

样品前处理方法: 准确称取银杏叶粉0.2g(精确至0.001g)于15mL具塞刻度离心管中，加入10mL 70%乙醇水溶液，超声萃取30min，静置，将上清液转移到25mL容量瓶中，下层残渣再用10mL 70%乙醇水溶液按前面的步骤提取一次，离心分离后，合并两次提取液并准确定容至刻度线。摇匀后，取1.0mL以10000r/min离心5min后，取上清液过0.22μm有机滤膜，待上UPLC — MS/MS分析。

UPLC — MS/MS分析条件：色谱柱: Shim-pack XR-ODSⅢ柱(2.0mm×75mm，1.6 μm)。流动相A∶0.1%乙酸，流动相B∶乙腈。梯度洗脱程序： 0～1 min，10% B～20% B；1～2.5min，20% B～35% B；2.5～5min，35% B～80% B；5～5.5min，80% B～95% B；5.5～8min，9.5% B～10% B；流速：0.3mL/min。柱温：40℃；进样量：5.0μL。离子源：ESI，负离子扫描；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子源接口电压：3.5kV；DL管温度：250℃；加热模块温度：400℃。芦丁定量离子对m/z 为609.2>300.25；定性离子对为m/z 609.2>270.90。

3 银杏叶样品近红外光谱的采集

将制好的粉末样品置于样品杯内，样品装至杯子的1/3～1/2处，样品杯放于旋转台上，采用积分球扫描样品，得到其近红外光谱图，根据标准值与光谱间的关系，建立相应的数学模型。本试验设置的仪器工作参数为：光谱采集范围4000～12500 cm-1，分辨率4cm-1，扫描次数：32次；开机预热光谱仪1h后，进行样品扫描，得到19个样品的近红外吸收光谱。

4 校正集和预测集样本芦丁含量的测定

从收集的19个样品中选取3个样品(河南洛阳、广西柳州、上海)作为预测集样本，其他16个样品作为校正集样本，以超高效液相色谱-串联质谱测定的19个银杏样品的芦丁含量作为标准值，结果见表1。

表1 银杏叶样品中芦丁含量的测定值Tab.1 ThedeterminationresultsofrutininGinkgobilobaleafsamples编号产地芦丁(mg/g)校正集1湖南长沙0.0323校正集2广西桂林0.0949校正集3湖南岳阳0.1539校正集4陕西西安0.3174校正集5广东广州0.3827校正集6甘肃陇南0.4322校正集7浙江杭州0.4835校正集8安徽黄山0.5178校正集9湖北武汉0.5194校正集10江苏南京0.6049校正集11北京0.6443校正集12湖南娄底0.6603校正集13重庆0.6899校正集14辽宁大连1.1623校正集15湖南邵阳0.6658校正集16湖南湘西0.0640预测集1河南洛阳1.0450预测集2广西柳州1.3325预测集3上海0.5287

5 数学模型建立

5.1 以银杏校正集样本建立数学模型

5.1.1 偏最小二乘法原理 根据一般模型，量测矩阵Y与样品内在信息矩阵C如浓度有如下关系：

Y=CB

B为系数矩阵。

偏最小二乘法不但对量测矩阵Y进行正交分解，而且在分解Y的同时将浓度矩阵C也进行正交分解。

Y=T*Vt*+Ey，C=R*Qt*+Ec

在进行同时分解时，考虑了矩阵T*和矩阵R*之间应有的线性关系，这就构成了偏最小二乘法的主要特点，即在分解矩阵Y时考虑矩阵C的因素，而在分解矩阵C时考虑矩阵Y的因素，交互效验相互影响，通过迭代时交换迭代矢量而使两个分解过程合二为一。

5.1.2 偏最小二乘回归模型的建立 采用MPA傅里叶变换近红外光谱仪所附带的OPUS 6.5分析软件，对所采集的16个校正集样本的近红外光谱数据进行偏最小二乘回归分析(PLS)。

由于采用的是商业软件内嵌的方法，模型的建立和优化都依赖于商业软件的内在程序。使用OPUS软件导入所得到的近红外光谱数据，并分为校正样品和预测样品。再利用软件中的模型优化功能，对模型参数进行优化，主要优化了近红外光谱数据的选择波长范围和光谱数据的预处理方法，并根据RMSECV的大小选择模型优化的参数组合。使用不同的光谱波长范围和多种光谱处理方法对原始光谱进行预处理，进一步使用交叉检验的方法，优化模型参数。经过比较，实验最终确定预处理方法为一阶导数和多元散射校正，建模光谱范围为7500～6099cm-1和5 450～4 249 cm-1，能够有效地减少样品的不均匀性、随机噪声等因素对模型建立的影响，建立了银杏叶近红外光谱与银杏叶中芦丁含量的定量模型(见图1)。

图1 样品近红外光谱图(A)和经过光谱预处理后样品的红外光谱图(B)Fig.1 Near-infrared spectra of samples(A) and spectral pretreatment samples (B)

5.2 以银杏预测集样本检验数学模型

以本研究建立的银杏叶中芦丁含量的数学模型对选定的3个预测集银杏样本进行测定，预测结果见表2，并与色谱检测结果相比较，以预测值与色谱检测的标准值比值为预测回收率，可得到预测集的平均回收率为98.40%。图2为近红外模型预测结果与色谱检测结果之间相关性，模型均方差为0.194，因子数为7。预测集检验结果表明上述模型适合银杏叶中芦丁含量的测定。

表2 预测集结果与色谱检测结果Tab.2 ThepredictionresultsofNIRmodelandthedetectionresultsofchromatography银杏产地色谱检测结果模型预测结果偏差预测回收率(%)河南洛阳1.04500.98170.063393.94广西柳州1.33251.3335-0.0010100.08上海0.52870.5349-0.0062101.17

图2 近红外模型预测结果与色谱检测结果之间相关性Fig. 2 The correlation between the prediction results of NIR model and the detection results of chromatography

6 结论与讨论

利用近红外光谱与色谱检测值，建立了银杏叶中芦丁含量的数学模型，并用此模型对银杏样品进行了预测，预测结果与色谱检测结果相吻合，偏差较小，说明模型具有一定的实际应用价值，能够用于银杏叶中芦丁的定量检测。但由于建立模型所用的样品数量较少，且代表性有限，因此需要采集更多有代表性的样品，以使模型具有更强的稳定性和适用性。

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TheestablishmentofthemathematicalmodelofrapiddeterminationofrutininGinkgobilobaleaves

DONG Yi1,2, ZHU Shaohua1, ZHANG Ying1*, ZHANG Fan1,3, HUANG Zhiqiang1, CHEN Bo2

(1.Hunan Academy of Inspection and Quarantine, Changsha 410004, China;2.Key Laboratory of Chemical Biology & Traditional Chinese Medicine Research, Ministry of Education, Hunan Normal University, Changsha 410004, China;3.Changsha Environmental Protection College, Changsha 410004, China)

After collecting the NIR-spectra of 19Ginkgobilobaleaves samples from different origin areas，multiplication signal correction and first derivative were conducted to optimize the original spectra with OPUS 6.5 software. In 7 500～6 099 cm-1and 5 450～4 249 cm-1range inside, the rutin content was quantitative detected quickly with partial least squares( PLS ) by choosing seven principal components, a rutin quantitative mathematical model ofGinkgobilobaleaf based on ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry results was established. The near infrared model prediction results were matched to the chromatographic detection results, model variance were 0.194 and the average recovery of predict ion samples was 98.40%. This method is rapid and simple, it can be used to quality control ofGinkgobilobamedicinal and high-volume products detection.

near infrared spectroscopy;Ginkgobilobaleaf; rutin; quantitative models

2015-03-06

国家质检总局科技计划项目(2012IK161)。

董 毅(1994-)，男，湖南省常德市人，硕士研究生，主要从事食品安全及检测研究。

* 为通讯作者。

R 284.1; O 657.33

A

1003 — 5710(2015)03 — 0045 — 05

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2015. 03. 011

(文字编校：张 珉)