黔东南产仙鹤草的原花青素含量和抗氧化能力测定

王云，孟立霞，薛白，李东平，夏薛梅，蔡凌云，*

1.凯里学院环境与生命科学学院，贵州凯里556011

2.四川农业大学动物营养研究所，四川雅安625000

黔东南产仙鹤草的原花青素含量和抗氧化能力测定

王云1，孟立霞1，薛白2，李东平1，夏薛梅1，蔡凌云1，2*

1.凯里学院环境与生命科学学院，贵州凯里556011

2.四川农业大学动物营养研究所，四川雅安625000

本文以黔东南产仙鹤草为材料，测定其原花青素含量和抗氧化能力，为黔东南产仙鹤草开发利用提供依据。采用微波辅助提取原花青素，通过紫外分光光度计，采用铁盐催化法测定原花青素的含量，用DPPH自由基法测定仙鹤草原花青素的抗氧化能力。实验结果表明，黔东南产仙鹤草原花青素的含量较高，为236.60 mg/g，对DPPH自由基的清除率30 μg/mL时高达92.85%。黔东南州产仙鹤草原花青素含量和抗氧化能力都较高，开发价值大。

仙鹤草；原花青素；含量；抗氧化能力

仙鹤草为蔷薇科龙芽草属植物龙芽草Agrimonia pilosa Ledeb Var.japonica（Miq.）Nakai的全草。别名脱力草、瓜香草、老牛筋、狼芽草。为多年生草本，高达1 m，全株具白色长毛。根茎短，常生1或数个根芽（越冬芽）。茎直立，被疏柔毛及腺毛。羽状复叶互生，小叶大小不等，间隔排列，卵圆形至倒卵圆形，长2.5～7 cm，宽1.5～3.5 cm，边缘有锯齿，两面均被柔毛；托叶近卵形。总状花序顶生；花萼倒圆锥形，5裂，裂片基部生多数钩状刚毛，宿存；花瓣5，黄色；雄蕊5～15；子房半下位，花柱突出。萼筒于果熟时增厚，下垂，顶端有一轮直立钩刺，外有较深纵沟，极似仙鹤头部，因而称仙鹤草。花果期5～12月。我国南北都有分布［1］。仙鹤草性平，味苦、涩。是良好的收敛止血药，传统多用于治疗各种出血症。如咳血，吐血，崩漏下血，疟疾，血痢，脱力劳伤，痈肿疮毒，阴痒带下等症。近年来研究发现，仙鹤草含有多种生理活性成分，如酚类化合物、黄酮类化合物以及糖苷类化合物、三萜类以及挥发油、甾体类化合物、脂类化合物、有机酸、鞣质类化合物，除此之外，仙鹤草中还含有铁、锰、铜、锌、钾、锶、钠、铝等多种微量元索以及维生素等成分［1，2］。现代药理学研究表明仙鹤草具有止血、抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、驱虫作用；能治美尼尔综合症、糖尿病；可做农药杀虫剂。临床上主要用于治疗咳血、吐血、疟疾、肿瘤等疾病［3-6］。仙鹤草还用于经济动物养殖［7-9］。目前对于黔东南州产仙鹤草原花青素的提取和含量测定及抗氧化性能笔者未见国内（外）文献报道。原花青素是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂［10，11］。清除自由基的能力是VE的50倍、VC的20倍，因高效、低毒、高生物利用率而被广泛用于食品、饮料、化妆品及保健用品等领域，市场应用前景非常广阔。笔者以黔东南州的仙鹤草为材料，结合研究方向，对其原花青素进行提取和测定等分析，可为黔东南州仙鹤草的质量评价及综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

上海新仪微波化学科技有限公司MAS-I2型常用微波合成仪，上海亚荣生化仪器厂RE-5299型旋转蒸发仪，岛津UV-2250紫外分光光度计，德国Eppendorf Research移液器；昆山市超声仪器有限公司KQ3200DE超声清洗仪，上海亚荣生化仪器厂SHZ-Ⅱ型循环水真空泵。

1.2 试药与材料

原花青素标准品（合肥博美生物科技有限责任公司，含量≥95%），香草醛、丙酮、甲醇、冰醋酸、乙醚、正丁醇、浓盐酸均为分析纯。蒸馏水为实验室自制。仙鹤草购于贵州省黔东南州凯里市中草药市场，经凯里学院蔡凌云教授鉴定为蔷薇科多年生草本植物仙鹤草Agrimonia pilosa Ledeb Var. japonica（Miq.）Nakai。

1.3 样品处理和提取液制备

仙鹤草经60℃干燥，打粉，粉末过100目筛，置于干燥器中备用。

取样品3.00 g，加30 mL丙酮+水（7：3）浸泡20 min，在40℃600 w条件下微波2 min，过滤，重复提取1次，合并滤液，在35摄氏度减压浓缩至10～20 mL，至无丙酮味，浓缩液加6 mL乙醚萃取，重复四次，合并萃取液定容至100 mL，备用。

取样品3.00 g，加30 mL甲醇+水（7：3），重复以上提取操作。

1.4 标准品溶液的制备

精密称取原花青素标准品10.00 mg，用甲醇溶解后，定容于50 mL的容量瓶中，得0.20 mg/mL的原花青素标准溶液，备用。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

精密吸取原花青素标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2 mL分别放入1～7号试管中，按“1. 4”项下的方法进行操作，每个浓度平行测定3次，以吸光度值（A）3次的平均值为纵坐标，原花青素浓度（C）为横坐标绘制标准曲线，计算其回归方程为：

A=8.0985 C－0.0009 R=0.9996，表明原花青素在0.0054～0.0324 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.2 最大吸收波长的确定

精密吸取一定量的原花青素标准溶液和样品溶液分别放入试管中，加甲醇补足体积至1.2 mL，加6 mL正丁醇-浓盐酸（95：5），加0.2 mL硫酸铁铵，充分振荡60℃热水浴避光反应60 min，冰水冷却至室温，在400～800 nm处进行扫描，结果得到标准品溶液与样品溶液的最大吸收值均在550 nm。

2.3 稳定性试验

取标准品溶液，按“1.4”项下方法操作，每隔5 min测定1次，记录在60 min内的吸光值，A=0.180、0.180、0.179、0.180、0.179、0.179、0.179、0.179、0.178、0.178、0.178、0.178，RSD为0.443%，表明测定方法稳定。

2.4 加样回收试验

精密吸取“1.3”项下制备的供试样品溶液10 mL稀释到100 mL，取0.2 mL，置于10 mL试管，共6份，再分别加入原花青素对照品溶液1 mL，按“2.2”项下方法操作，测定吸光值，计算回收率，结果见表1，表明测定方法准确度好。

表1 加样回收率Table 1 Recovery percentage of sample

2.5 精密度试验

吸取标准品溶液置于10 mL试管中，共6份，于最大吸收波长550 nm下测定吸光值为0.057、0.057、0.054、0.058、0.057、0.055，计算RSD为2.68%，说明精密度良好。

2.6 样品中原花青素提取溶剂选择和含量测定

取1.3制备样液按2.2项方法分别测定吸光值，见表2。结果表明溶剂为丙酮+水（A=1.550、1.566、1.542）的提取率高于甲醇+水（A=1.354、1.327、1.377），故采用丙酮+水（7：3）为提取溶剂。

取1.3制备样液0.2 mL（丙酮+水），按2.2项下方法分别测定吸光值，取3次的平均值代入回归方程计算出仙鹤草粉末中原花青素的含量，含量为236.60 mg/g。

2.7 样品原花青素对DPPH自由基清除率的测定［12］

取1.3项下制备的提取液（丙酮+水），配制成不同质量浓度的仙鹤草原花青素提取溶液（30、60、90、120、150、180 μg/mL），取样液2 mL加入2 mmol/L DPPH溶液2.0 mL，加塞，摇匀，在25℃避光反应30 min，取出，测定517 nm波长处的吸光度。用蒸馏水代替DPPH溶液测定吸光度。仙鹤草原花青素对DPPH自由基的清除率见图1。

图1 仙鹤草原花青素提取溶液对DPPH自由基的清除率Fig.1Scavengingratesof procyanidinefromAgrimonia pilosaat differentconcentrationsagainstDPPHfreeradicals

由图1可知随仙鹤草原花青素质量浓度的增大对DPPH自由基的清除率增强，但仙鹤草原花青素在很低浓度范围内即对DPPH自由基有极高的清除率（30µg/mL是清除率为92.85%），差异性分析表明，在所选质量浓度范围内，仙鹤草原花青素对DPPH自由基的清除率差异不显著（P＞0.05）。说明仙鹤草原花青素的抗氧化性能强，低浓度即有好的抗氧化能力，是良好的天然抗氧化剂。

3 结论与讨论

（1）原花青素的提取溶剂可以用丙酮、甲醇等，本研究考察了两种提取剂对仙鹤草原花青素提取的影响，结果表明丙酮+水（7：3）作为提取剂提取率较高。

（2）原花青素含量的测定方法有香草醛甲醇-浓盐酸法、铁盐催化法等、本研究采用铁盐催化法，经精密度、稳定性、加样回收等试验，结果表明铁盐催化法用于仙鹤草原花青素含量测定准确可行。

（3）随着近年相关研究的发展，仙鹤草的相关生物活性不断被发现，最典型的是抗肿瘤、降血糖、增强免疫功能、降血压、镇痛抗炎等生物活性。仙鹤草的抗肿瘤研究已经有了大量的文献报道，这些抗肿瘤机理的研究都很可能利用了仙鹤草活性成分中的抗氧化成分，由此可见仙鹤草是一种极有潜力的天然抗氧化剂中药和天然药用植物资源［13-15］。本研究表明黔东南产仙鹤草原花青素含量为236.60 mg/g，在30 μg/mL时，仙鹤草原花青素对DPPH自由基的清除率即高达92.85%，是良好的抗氧化剂。为黔东南产仙鹤草开发提供理论依据。

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Determination on the Procyanidin Content and Antioxidation in Agrimonia pilosa Ledeb from Qiandongnan

WANG Yun1，MENG Li-xia1，XUE Bai2，LI Dong-ping1，XIAXue-mei1，CAI Ling-yun1，2*
1.College of Environment and Life Science，Kaili University，Kaili 556011，China
2.Animal Nutrition Institute，Sichuan Agricultural Universiyt，Yaan 625000，China

This paper determined the procyanidin content and its antioxidation in Agrimonia pilosa Ledeb from Qindongnan so as to provide basis for the development of procyanidin.The vanillin-glacial acetic acid spectrophotometry was used to determine procyanidin content in A.pilosa，The scavenging activities on DPPH free radical were evaluated by spectrophotometry.The experiments results showed that the procyanidin content and antioxidation was higher in A.Pilosa，and the procyanidin content was 236.60 mg/g，DPPH free radical clearance rate was 92.85%（30µg/mL）.The procyanidin content and antioxidation in A.Pilosa from Qiandongnan were higher，so it was a kind of medicinal plants with high value for development..

Agrimonia pilosa Ledeb；procyanidin；content；antioxidation

R284·2

A

1000-2324（2015）01-0047-04

2012-10-23

2013-02-03

贵州省科技厅项目（KJT201101）；凯里学院重点项目（ZX201201）；贵州省科技厅项目（黔科合J字［2013］2258）；国家自然科学基金（31201160）

王云（1966-），女，苗，学士，教授，主要从事苗药在动物养殖中的应用研究.E-mail：1073580243@qq.com

*通讯作者：Author for correspondence.E-mail：125906640@qq.com