运动预处理后内源性阿片肽对大鼠心肌缺血再灌注损伤早期保护作用

王 强，闻剑飞，汪 辉，陆保云，胡 俊

（合肥师范学院 体育科学学院，合肥 230601）

阿片肽是一大类由脑啡肽、强啡肽、内啡肽、孤啡肽和内吗啡肽共同构成的蛋白质超家族，其广泛分布于神经系统。它们含有酪氨酸－甘氨酸－甘氨酸－苯丙氨酸－甲硫氨酸五个关键性共同序列，这一序列是阿片肽和受体结合并表现出生物活性所必需的。近年来研究表明，包括心脏在内的多种外周组织器官具有分泌阿片肽的作用，心肌细胞表面表达多种阿片受体。

大量研究证实［1－2］，内源性阿片肽的释放在心肌缺血预适应早期和晚期保护中均发挥了重要作用，而且保护效应可以被阿片受体阻断剂取消。Dickson等人研究发现［3］，使用阿片受体阻断剂纳洛酮可以部分取消运动预适应的延迟性心肌保护效应。我们前期的研究也发现［4］，外源性阿片物质——吗啡联合运动预处理具有协同降低晚期心肌缺血再灌注损伤的作用，这一协同作用可被阿片受体阻断剂纳洛酮阻断，运动预处理的心肌保护作用可能部分由阿片肽心肌细胞信号通路介导。目前，有关运动预适应能否直接触发内源性阿片肽分泌增加并在心肌缺血再灌注损伤早期发挥保护作用还鲜有报道。本研究通过观察运动预处理后早期体液中阿片肽含量的变化，探讨运动预处理早期心肌保护的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康雄性SD 大鼠80只（由扬州大学比较医学动物中心提供），体重为200—220 克，常规分笼饲养，5 只／笼，自由摄食饮水，室温控制在26—28 ℃，相对湿度40%—60%，自然光照。大鼠购回后，按照10米／分钟的速度进行跑台运动，每天运动10分钟适应一周，剔除不能正常运动的个体，选取60 只，按体重分层，随机分成假手术组（sham 组）、缺血再灌注模型组（I／R 组）、运动预适应组（EP组）、运动预适应＋纳洛酮阻断组（EPN）。分组如下：①sham 组，大鼠静置于跑台上，连续3天不运动，最后一次结束后即刻麻醉再进行手术，只穿线不结扎；②I／R 组，大鼠静置于跑台上，连续3天不运动，最后一次结束后即刻麻醉再进行手术，穿线结扎冠状动脉前降支，复制心肌缺血再灌注模型；③EP组，采用短期运动预适应模型，连续进行3天间歇性跑台运动，最后一次运动结束后即刻再复制I／R模型；④EPN 组，运动方案同EP 组，最后一次运动结束后即刻静脉注射纳洛酮再复制I／R 模型。

1.2 主要仪器和试剂

高速低温离心机（TGL－16G－A，上海安亭），多道生理记录仪（BL－420S，成都泰盟），紫外可见分光光度计（SHIMADZU，日本岛津），原子吸收分光光度计（AA－7000，日本岛津）；心肌肌钙蛋白I检验试剂盒（美国，武汉优尔生公司进口分装），诱导型一氧化氮合酶检验试剂盒（美国，武汉优尔生公司进口分装）。

1.3 动物模型的建立

1.3.1 大鼠心肌缺血再灌注模型的建立

大鼠以戊巴比妥钠（麻醉剂量按50mg／kg体重）腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术台，气管插管，采用微型动物呼吸机人工通气，右颈动脉插管至左心室，连接多道生理记录仪记录血流动力学指标，并监测肢体Ⅱ导联心电图，于胸骨左侧第4—5肋间开胸，暴露心脏，剪开心包膜，除sham 组冠状动脉左前降支只穿线不结扎，其余各组在冠状动脉左前降支距左心耳下缘2毫米处进针，穿过表层于肺动脉圆锥旁出针，用直径约2毫米PE 管穿过结扎线，稳定15 分钟后行缺血30分钟再灌注60分钟，复制心肌缺血再灌注模型，以心电图ST 段明显抬高、T 波倒置、结扎线以下心肌组织由红色变为苍白或紫绀为心肌缺血标志。

1.3.2 大鼠运动预适应模型的建立

参考Dickson等［3］和潘珊珊等［5］文献报道建立运动预适应动物模型，EP组和EPN 组大鼠进行连续3天的间歇性跑台运动，运动速度为35 米／分钟，坡度为零，运动时间为60分钟，以15 分钟运动、5 分钟休息为一组，重复3 组，以模拟反复多次的短暂心肌缺血再灌注。每次训练开始前，先进行5 分钟适应跑，从15 米／分钟逐渐增加到35 米／分钟，训练后5分钟内再从35米／分钟逐渐降到15米／分钟。

1.4 动物取材与样本制备

（1）于缺血前30分钟、缺血后30分钟及再灌注60分钟后记录心电图和血流动力学指标。

（2）再灌注60 分钟后，经腹主动脉分别取血2 ml、5ml，前者静置30分钟后离心，后者加抗凝剂静置30分钟后离心，取上清液－20 ℃保存待用。

（3）再灌注60分钟后，取血结束后即刻取出心脏，经预冷的灭菌生理盐水清洗后，置于液氮中，－80 ℃冻存待用。

1.5 测试指标与方法

1.5.1 血流动力学指标

经右侧颈总动脉插管至左心室，由生理压力传感器输出至多道生理记录仪，读取左室收缩压（LVSP），左室舒张末期压（LVEDP），左室内压最大变化速率（±dp／dtmax）。

1.5.2 血清心肌肌钙蛋白I（cTnI）的测定

采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清cTnI，按试剂盒上说明要求测定。cTnI试剂盒由优尔生公司进口分装。

1.5.3 血浆β－内啡肽、强啡肽A 和亮氨酸－脑啡肽的测定

采用ELISA 测定血浆β－内啡肽、强啡肽A 和亮氨酸－脑啡肽，试剂盒由优尔生公司进口分装。

1.5.4 心肌细胞内Ca2＋浓度测定

心肌组织在含有1μg／L蛋白酶抑制剂（protease inhibitor）的磷酸缓冲盐溶液（PBS）中匀浆，低温离心机（4 ℃）上高速离心15 min（12 000rpm），取上清储存于－80 ℃冰箱中。使用去离子水按照100∶1 稀释心肌匀浆液，采用原子吸收分光光度法在WFX－1F 原子吸收分光光度计上测定心肌组织中Ca2＋浓度。

1.6 统计学处理

采用SPSS18.0统计软件处理实验数据，所用数据均以均数±标准差表示，均数间的两两比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异性，表示具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 血流动力学变化

表1 各组缺血前、缺血30分钟和再灌注60分钟后血流动力学指标比较

各组在缺血期（I期）和再灌注期（R 期）LVSP 和±dp／dtmax较缺血前（B 期）均下降，LVEDP 较缺血前上升；I／R 组 和EPN 组在缺血30 分钟和再灌注60 分钟后LVSP和±dp／dtmax较sham 组下降明显，有统计学意义（P＜0.05），EP组较sham 组LVSP和±dp／dtmax值降低，但无统计学差异（P＞0.05）；与I／R 组相比，EP 组和EPN 组在缺血前后LVSP、LVEDP和±dp／dtmax降低幅度减小，但没有统计学差异（P＞0.05），EP 组在再灌注期LVSP±dp／dtmax降低幅度明显减小（P＜0.05）；与EP 组相比，EPN组在缺血期各项指标变化不明显，但在再灌注60 分钟后LVSP和—dp／dtmax值下降，且具有显著性差异（P＜0.05）。

2.2 血清心肌肌钙蛋白I（cTnI）变化

血清cTnI是反映心肌损伤的金标志，与sham 组相比各组血清cTnI均明显升高，有显著性差异（P＜0.05）；与I／R 组相比，EP组血清cInI漏出明显减少，具有显著性差异（P＜0.05），EPN 组血清cTnI降低，但差异不显著；与EP组相比，EPN 组中血清cTnI值明显升高，有统计学意义（P＜0.05）。

图1 大鼠血清心肌肌钙蛋白I比较

2.3 血浆β－内啡肽、强啡肽A 和亮氨酸－脑啡肽变化

I／R 组、EP组和EPN 组血浆中β－内啡肽、强啡肽A 和亮氨酸－脑啡肽与sham 组相比均有增加，除I／R 组血浆中L－Enk浓度与sham 组差异不显著外，其余各组均具有明显差异（P＜0.05）。与I／R 组相比，EP 组和EPN 组血浆中β－End、Dyn A、L－Enk浓度均明显升高，且有显著性差异（P＜0.05）。EP组与EPN 组各项指标差异不显著。

表2 大鼠血浆中β－内啡肽、强啡肽A 和亮氨酸－脑啡肽值比较

2.4 心肌细胞内钙离子浓度变化

心肌细胞胞浆中Ca2＋是心肌舒缩的重要信号分子，也是心肌细胞缺血再灌注损伤的重要介质。与sham 组相比，各组心肌细胞胞浆中Ca2＋浓度均明显升高，有显著性差异（P＜0.01或P＜0.05）；与I／R 组相比，EP 组心肌细胞胞浆中Ca2＋浓度明显降低，具有显著性差异（P＜0.05），EPN 组心肌细胞胞浆中Ca2＋浓度有降低趋势，但差异不显著（P＞0.05）；与EP 组相比，EPN 组中心肌细胞胞浆中Ca2＋浓度明显升高，有统计学意义（P＜0.05）。

图2 大鼠心肌细胞中钙离子浓度比较

3 讨论

3.1 运动预适应对心肌缺血再灌注的早期保护效应

心肌缺血再灌注损伤是心脏动脉搭桥、经皮腔内冠脉血管成形术、心脏外科体外循环、心肺复苏等心血管手术的重要临床病理生理过程。大量研究表明［6－7］，心肌缺血预处理（IPC）可以产生强大的内源性心肌保护效应，降低术后恶性心律不齐的发生几率，提高缺血期和再灌注期心肌存活率。近些年的研究发现［8］，运动预处理可以诱导产生类似于缺血预处理的心肌保护效应，而且存在早期和晚期两个保护时相。缺血预处理的早期保护时相一般发生在IPC 后数分钟，并持续1—3小时。Tomai等人［9］让犬进行5次连续的5分钟跑台运动和5分钟间歇，发现1小时后由冠脉夹闭引起的心肌梗死面积显著减轻，表明运动预适应亦可以产生类似于IPC的早期保护作用。Domenech等人［8］通过建立的犬运动模型研究发现，间歇性运动可以降低随后心肌缺血再灌注的损伤，减小心肌梗死面积，同样验证了EP具有早期保护作用。张敏等人［10］利用Wistar大鼠低压舱负重游泳建立了运动预适应模型，结果表明运动预适应可以在早期对抗心肌缺血再灌注损伤，且有可能是通过提高心肌细胞抗氧化能力发挥保护作用的。本课题前期［4］的研究对SD 大鼠进行大强度间歇跑台运动（速度35 米／分钟，运动15 分钟、休息5分钟，重复3次），60 分钟／天，共3 天，以模拟IPC 的反复多次短暂的心肌缺血／再灌注，建立EP 动物模型。研究发现［3］，EP可以明显减轻大鼠心肌缺血再灌注的损伤程度，发挥心肌保护效应，而且这一保护效应可被阿片受体阻断剂纳洛酮取消，为进一步探讨EP对大鼠心肌缺血再灌注早期保护效应的研究奠定了基础。

3.2 阿片肽介导的心肌缺血预适应对心肌缺血再灌注早期的保护效应

机体多种组织均具有分泌阿片肽的功能，心脏亦可以通过自分泌和旁分泌的调节方式合成和释放内源性阿片肽。Springhorn等研究发现［11］，心肌细胞中存在Enk、Dyn及其受体和End mRNA 表达，其中Enk 和Dyn 含量明显高于End，其含量受到心脏生理和病理功能变化的影响，当心脏受到应激刺激时，Enk和Dyn合成、释放增加，同时其受体表达亦上调。目前研究［12］证实了μ、δ、κ和orphanin－FQ（OFQ）四种功能相对明确的阿片受体，除此之外，研究还发现了一些阿片受体亚型，以上四种受体都具有特异性的内源性配体，分别是End、Enk、Dyn 和orphanin。研究证实［13－14］，心肌细胞膜和亚细胞器膜均存在阿片受体，人体心脏表达δ、κ、μ－OR 三种受体，成年大鼠心脏则以δ、κ－OR 为主。

大量研究证实，阿片肽参与介导了IPC保护作用。心肌缺血预适应时，阿片类物质通过神经系统、内分泌系统和心脏自分泌等途径释放到心肌组织，与特异性受体结合，参与IPC早期心肌保护作用。Schultz等［1］在开胸大鼠的心肌梗死模型研究中发现，30分钟缺血90分钟再灌注前给予静脉注射吗啡3次（100μg／kg）能减小心肌缺血梗死面积，纳洛酮能阻断吗啡的保护作用，预处理前给予δ受体拮抗剂亦能消除保护作用，认为δ受体主要介导了预处理。Fryer等人［15］进一步证实内源性阿片肽及受体在IPC 早期和晚期中均发挥了重要作用。Peart等［16］用κ－OR 激动剂预处理SD大鼠，能显著减少经历30分钟缺血及90分钟再灌注导致的心肌梗死面积，并且可以降低心律失常的发生率。张鹏等［17］发现事先给予SD 大鼠选择性κ 阿片受体激动剂U50488H，可以达到与强啡肽类似的效应，改善缺血再灌注后的心脏功能，降低心肌超微结构损伤，提示内源性强啡肽及受体在心肌缺血预适应中的作用。心肌缺血预适应过程中内源性阿片肽释放对心肌缺血再灌注损伤早期保护作用和机制研究为本课题的开展提供了理论基础和实践依据。

3.3 内源性阿片肽介导的运动预适应对心肌缺血再灌注早期的保护效应及可能机制

心肌缺血再灌注损伤过程中细胞内钙超载既是缺血再灌注损伤的机制，又是缺血再灌注损伤的结果，也是导致细胞发生凋亡、胀亡、坏死等不可逆损伤的主要病理过程。因此，降低再灌注期胞内和线粒体内钙超载是心肌缺血再灌注损伤干预的主要干预靶向。细胞内钙稳态是Ca2＋跨膜转运和胞内钙库动态平衡的结果。在生理状态下，心肌细胞兴奋收缩偶联，胞外Ca2＋内流较少，主要是通过激活肌浆网上Ca2＋通道，使胞内钙库中Ca2＋释放，升高的Ca2＋可在肌浆网和线粒体膜上Ca2＋泵作用下，重新泵回钙库，胞浆中Ca2＋浓度下降，心肌舒张。心肌缺血再灌注时，由于细胞膜、线粒体和内质网膜受损，胞外Ca2＋内流增加，线粒体和内质网摄取Ca2＋减少，导致胞内钙增加，同时，细胞膜上Na＋－Ca2＋交换蛋白逆向转运增加，从胞外摄取Ca2＋增多，另外，儿茶酚胺释放增多，激活细胞膜上α1－肾上腺素能受体和β肾上腺素能受体，经由受体后途径，导致肌浆网释放增加，膜上Na＋－Ca2＋交换增多，膜上受体门控钙通道和电压门控钙通道开放加强。从而促进钙内流，进一步加重细胞内钙超载［18］。本研究结果显示，心肌缺血再灌注后I／R 组较sham 组胞内Ca2＋浓度显著升高，与以上理论结果一致，EP组胞内Ca2＋浓度较sham 组升高，但差异不显著，EP组Ca2＋浓度显著低于I／R 组，说明EP早期具有维持心肌缺血再灌注细胞内钙稳态的作用。本实验EPN 组胞内Ca2＋浓度高于EP组，并有显著性差异，与I／R 组相比Ca2＋浓度降低，但差异不显著，说明阿片肽及受体后途径至少部分介导了运动预适应早期维持I／R 细胞内钙稳态。大量研究证实［19－20］，IPC能通过神经内分泌途径升高血浆阿片肽水平，并增加心肌组织内阿片肽的合成释放，发挥心肌保护效应。本实验研究显示，运动预适应后血浆内啡肽、强啡肽和脑啡肽水平升高，显著高于sham 组和I／R 组。大鼠心肌细胞δ、κ－OR属于G 蛋白偶联受体。研究发现［21］，内源性强啡肽、脑啡肽释放与心肌细胞膜上G 蛋白偶联受体结合，通过抑制β－肾上腺素受体与Gs蛋白结合，负性调节β－肾上腺素受体及其下游腺苷酸环化酶（AC）活性，减少细胞内环腺苷酸（cAMP）的生成，抑制磷脂酶C（PLC），进而降低三磷酸肌醇（IP3）和二脂酰甘油（DAG）的合成，减少IP3诱导的肌浆网Ca2＋释放，降低蛋白激酶C（PKC）活性，从而抑制H＋—Na＋交换，进一步减少细胞内外Na＋—Ca2＋交换。阿片肽亦可以活化细胞膜KATP 通道激活，使胞内K＋外流，心肌细胞膜超极化，电压依赖性Ca2＋通道关闭，Ca2＋内流减少。本研究显示，运动预处理早期内源性阿片物质释放增多，血浆内啡肽、强啡肽和脑啡肽升高。符荣根等人证实［22］，运动应激引起的血浆脑啡肽释放具有抑制交感肾上腺系统的功能。它们可能通过抑制交感神经的兴奋性，减少儿茶酚胺类递质释放，从而抑制β肾上腺素能受体门控性钙通道和L 形电压门控钙通道，最终减轻细胞内在缺血再灌注期的钙超载。细胞内钙稳态的维持具有保护细胞膜的作用，细胞内Ca2＋增加可以激活磷脂酶，后者使膜磷脂降解加速，破坏膜结构，导致细胞内容物溢出增多。

血清心肌肌钙蛋白I（cTnI）是评估心肌损伤的早期重要标志物，具有高灵敏性、高特异性、出现早、持续时间长等特点，是目前临床上公认的衡量心肌受损的金标准。生理状态下，cTnI大部分以结合的形式存在于肌原纤维上，少量游离于细胞胞浆中，cTnI不能穿过细胞膜，血液中含量极低，当细胞膜受损时，弥散到细胞间质，进入血液循环。研究证实［23］，I／R 导致细胞内钙超载，胞内高钙可激活钙依赖性降解酶和钙蛋白酶，引起肌纤维挛缩和断裂，心肌细胞胞浆中游离肌钙蛋白增加，同时细胞膜受损，cTnI漏出增加。本研究结果显示，心肌缺血再灌注损伤引起血清cTnI升高，EP具有减少IPC早期cTnI漏出的作用，这一效应可以被阿片受体阻断剂纳洛酮取消，表明EP早期在维持细胞结构完整性，减少I／R 损伤中发挥重要作用，而上述效应可部分由阿片肽及受体介导。

LVSP、LVEDP、±dp／dtmax等血流动力学参数是评价心脏舒缩功能的基本指标。心肌缺血再灌注会引起心脏收缩功能减弱、舒张功能障碍，直接导致心脏功能下降。临床研究发现，心肌缺血和再灌注期间，心脏功能处于降低状态，具体表现为LVSP减小、LVEDP增加、±dp／dtmax降低。心肌缺血再灌注发生时，心肌能量代谢障碍，引起心肌收缩力减弱、LVSP 减小，心脏射血期泵血减少，心脏后负荷增加，导致LVEDP增加。心肌收缩力的降低使反映心脏收缩能力的指标＋dp／dtmax减小，细胞内钙超载导致心肌纤维挛缩，心脏顺应性和舒张功能下降，—dp／dtmax减小。本研究结果显示，I／R 能引起心脏舒缩功能障碍，导致LVSP和±dp／dtmax值降低、LVEDP值增加，EP 组较I／R 组各项指标相对稳定，EPN 组较EP 组在再灌注期LVSP 和—dp／dtmax值下降，表明EP能够维持心肌在缺血和再灌注期的舒缩功能，而这一效应可能与细胞内钙稳态维持有关。

4 小结

运动预适应对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有早期保护效应，其机制可能是：运动预处理后机体神经—内分泌系统阿片肽释放增加，阿片肽通过对抗交感神经兴奋作用和经阿片受体后途径维持细胞内钙稳态，保持细胞结构完整和功能正常，维持心脏舒缩功能，发挥其早期的保护效应。然而，内源性阿片肽介导的运动预适应对心肌缺血再灌注早期作用的细胞信号转导通路还不十分清晰，缺乏完整链条式的解析，信号交叉效应了解还不全面，这些问题将成为下一步研究的重点。

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