奥利司他低温溶析结晶条件的优化

闫同顺，杨金艳

（1.鲁南制药集团股份有限公司 国家手性制药工程技术研究中心，山东 临沂 276006；2.临沂大学生命科学学院，山东 临沂 276000）

奥利司他低温溶析结晶条件的优化

闫同顺1，杨金艳2

（1.鲁南制药集团股份有限公司 国家手性制药工程技术研究中心，山东 临沂 276006；2.临沂大学生命科学学院，山东 临沂 276000）

为了寻找一种高效的奥利司他结晶工艺，对溶剂种类、晶种、反溶剂加入量、待结晶溶液浓度、搅拌转速和降温速度等因素进行了研究。通过静态结晶实验，确立了甲醇/水为最佳的结晶体系及其比例，加入晶种能明显提高奥利司他的析晶温度，提高产品含量和纯度。在此基础上，经正交试验设计L9（34），通过50 L结晶罐动态考察了各因素对奥利司他结晶产品含量和收率的影响，并进一步优化了加水方式。结果表明：按照2℃/h速率降温，初始奥利司他质量浓度为30 g/L，反溶剂水的加量为25%（体积分数），分2次加入，析晶前加入产品质量0.1%的晶种，搅拌转速250 r/min条件下，所得奥利司他晶体含量和收率最高。经高效液相色谱（HPLC）检测，奥利司他含量可达98.6%，收率可达85.3%。

奥利司他；溶析结晶；溶析剂；优化

奥利司他（orlistat）是一种非全身作用的、具有良好耐受性和有效性的新型减肥药物，可不用食欲抑制剂而治疗肥胖，为肥胖症的药物治疗开辟了新途径［1］。该药品目前已在全球100多个国家上市，拥有近千万使用者。

奥利司他可以通过生物发酵或全合成2种方法获得，生物发酵由于收率高、成本低而被广泛采用。但是，生物发酵所得产品由于相似杂质多，难以提纯，有关奥利司他纯化的工艺报道大多采用硅胶柱层析或制备液相技术［2-4］，成本较高。结晶是纯化大多数化学药物的有效方法，常用的结晶方法有冷却结晶、共沸结晶和溶析结晶等。对于冷却结晶，溶质的过饱和度是由降温方式决定的，是影响冷却结晶最为重要的因素［5］，产品析晶前后，搅拌转速对晶体粒度分布、大小、纯度都具有非常显著的影响［6］。而溶析结晶，是通过加入反溶剂，使溶质的溶解度降低到过饱和状态而结晶，溶析剂的加入量、加入方式对结晶有明显影响［7-9］。在物质的结晶过程中，有控制地加入一定量的小晶种到结晶溶液中，以获得最大结晶产品的收率及使最终产品达到预定的要求［10］，但是加晶种时溶液的饱和度不宜过高，否则容易造成晶种和二次成核的聚结［11］。总之，提高奥利司他产品质量的关键在于结晶过程的优化和控制。

本文将冷却结晶和溶析结晶2种方式结合，通过结晶参数和结晶过程优化，力求寻找一条结晶温度适中，产品质量较好的结晶工艺。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

奥利司他粗品，质量分数93%，纯度为95%，其制备方法为发酵液经溶剂浸提、过滤、萃取、浓缩等多步操作处理得奥利司他中间体，中间体用庚烷溶解后，经钯炭氢化，制成奥利司他氢化液，庚烷结晶1次后即得奥利司他粗品。奥利司他晶种及对照品，质量分数99.2%，纯度99.5%。奥利司他粗品及晶种和对照，均为实验室发酵生产自制。分析纯甲醇、丙酮、乙醇均为西陇化工股份有限公司，色谱纯乙腈为国药集团化学试剂有限公司，医药级甲醇为淄博市临淄天德精细化工研究所。

Agilent 1100高效液相色谱仪（HPLC），Agilent Technologies；DLSB-30/40型低温循环制冷机，郑州长城科工贸有限公司；GR-50L双层玻璃反应釜，郑州长城科工贸有限公司；BT100-2J型蠕动泵，保定兰格恒流泵有限公司；SHB-B88型水循环真空泵，郑州长城科工贸有限公司；30 cm布氏漏斗，10L抽滤瓶，蜀牛玻璃仪器有限公司；Nikon Eclipse E100型显微镜，尼康（中国）有限公司；BC/ BD-270SH型冰柜，海尔集团；DZF-605B型真空干燥箱，巩义市英峪高科仪器厂；YC7144型油泵，临海市春华电机厂。

1.2 实验方法

1.2.1 奥利司他静态结晶

取一定量的奥利司他粗品，加入含一定体积纯化水的溶剂中，40℃加热至完全溶解，放入-5℃冰柜中，使其自然降温析晶。

1.2.2 晶种对奥利司他结晶的影响

对放入冰柜内甲醇/水结晶体系，分加晶种和不加晶种进行结晶处理，开始析晶时用温度计测析晶温度，所得产品低温抽滤，25℃真空干燥得干粉。

1.2.3 奥利司他动态结晶

取1 kg奥利司他粗品加热至40℃使其在甲醇中完全溶解，过滤得透明滤液，将澄清的溶液移入50 L玻璃反应釜中，用甲醇调配至所需浓度，开启低温浴槽降温、循环，开启机械搅拌，向溶液中流加纯化水，体系变混前加入晶种，降温至奥利司他结晶析出，养晶1 h，待降温至一定温度，布氏漏斗过滤得晶体，用体积分数75%预冷的甲醇/水洗涤，25℃真空干燥即得奥利司他干粉。

1.2.4 奥利司他含量和收率的计算

所得奥利司他晶体干燥后，用高效液相色谱（HPLC）按照USP35指定的外标法（略有改进）进行含量的测定。纯度计算按照面积归一化法。奥利司他母液浓度采用事先制作的标样曲线，流动相稀释10倍后，过0.45 μm滤膜，按进样量20 μL进行HPLC分析，计算浓度和收率。色谱系统条件：色谱柱C-18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相V（乙腈）∶V（85%磷酸）∶V（水）=860∶0.05∶140；检测波长195 nm；进样量20 μL；流速1.2 mL/min；柱温30℃。

2 结果与讨论

2.1 结晶溶剂的选择

选择一种合适的结晶溶剂，不但要考虑结晶的除杂效果、晶体的过滤速度、结晶收率，更要考虑该种溶剂的价格。从甲醇、乙醇、丙酮3种溶剂出发，配制质量浓度30 g/L的奥利司他，通过向溶剂中加入25%（体积分数）的纯化水，使其在-5℃冰柜内自然降温结晶。利用Nikon Ecipse E100型显微镜观察晶形。图1为奥利司他分别在甲醇、乙醇、丙酮3种溶剂中的晶形照片。由图1可知：奥利司他在乙醇、丙酮中结晶完过滤时，母液质量浓度分别为7.5和5.2 g/L，收率较低，此2种溶剂不适合作为结晶溶剂，而且乙醇结晶时，所得奥利司他晶形为圆球形与针状共存，晶形细，较难过滤，不适合工业化生产。甲醇/水析晶温度高（5℃），-5℃过滤时母液质量浓度3.5 g/L，能保证结晶的收率，晶形为长针状、粗壮、均匀，较好过滤，除杂明显且价格便宜，所以选择甲醇为后续的实验结晶溶剂。

图1 奥利司他在不同溶剂中的结晶晶形照片（×400）Fig.1 Images of different crystal forms of orlistat on different solvent types（×400）

2.2 晶种对奥利司他结晶的影响

一般情况下，加入晶种可以抑制初级成核，有利于晶体生长。本实验中加入溶质质量分数为0.1%的奥利司他作为晶种，结果见图2。从温度计测量结果可知，加入晶种能显著提高奥利司他的析出温度，从6℃提高至10℃；由图2可知，加入晶种有利于结晶过程的控制和杂质的去除，但在最后过滤时对奥利司他收率无明显影响。这可能与奥利司他在甲醇/水结晶体系比例确定的前提下，溶解度为一定值有关。加入晶种所得奥利司他产品纯度及含量明显高于不加晶种结晶所得产品与高海见等［12］研究结果一致。

图2 晶种对奥利司他结晶的影响Fig.2 Effects of seed on orlistat crystallization

2.3 动态结晶工艺的优化

通过静态实验，初步确定了甲醇/水为奥利司他最佳结晶溶剂体系，结晶过程中加入晶种可以较好地控制结晶过程。在此基础上，动态结晶实验采用50 L结晶罐，以奥利司他结晶后产品含量和收率为考察指标，通过正交实验L9（34）（表1）对结晶过程中水的加入量、待结晶溶液浓度、搅拌转速和降温速度等因素进行了研究，结晶实验均在0℃过滤，收集晶体、洗涤、真空干燥。从表2可以看出：以奥利司他结晶所得产品含量为响应值，结晶过程中以溶剂水的加入量为主要因素，对奥利司他产品含量影响显著，其次为待结晶产品浓度，降温速度影响最小，以含量为考察指标的最佳水平组合为A2B2C2D2。以结晶收率为响应值，由表3可知：水的加入量对结晶收率影响最为明显，而转速和降温速度对结晶收率影响最小，其最佳组合为A3B3C3D2，综合含量和收率，最优组合为A2B2C2D2。从正交试验可以得出：在奥利司他结晶过程中，水的加入量对产品含量和收率影响最为显著，其次是待结晶溶液浓度，而搅拌转速和降温速度影响较小。因此，奥利司他结晶时，一定要控制好水的加入量，在控制收率的同时，避免水的过量加入，这样可以有效去除杂质，保证结晶产品的质量。

2.4 加水方式对奥利司他结晶的影响

奥利司他甲醇结晶过程中，水的加入量对产品含量和收率影响极为显著，在综合考虑产品质量与收率的情况下，确定了加入结晶体系25%（体积分数）的水为最佳值。在正交试验优化基础上，对水的加入方式分3种情况进行考察：①结晶降温前一次性全部加入；②结晶降温前一次性先加入1/2体积，等温度降至5℃时30 min内再流加完剩余的1/2体积；③降温至5℃时1 h一次性流加完，结果见图3。通过HPLC分析母液计算出3种加水方式结晶收率均为85.3%，由此可知，在加水量确定的情况下，加水方式对结晶收率无影响。由图3可知：纯水在结晶前分2次加入与在5℃ 1 h流加完所得奥利司他晶体含量、纯度都较好，且两种方式产品质量相当，从时间角度考虑，采用第二种方式加水（流加时间为第三种方式的一半），此时得到的奥利司他的含量为98.6%，收率为85.3%。纯水在降温前一次性全部加入，所得晶体含量和纯度较差，这可能与水的一次性快速加入，导致产品析晶过快，晶种起不到应有的作用，析晶过程难以控制有关。

表1 正交试验结果L9（34）Table 1 Results of orthogonal experiment

表2 正交试验结果分析（以产品含量为响应值）Table 2 Analysis results of orthogonal experiment on content

表3 正交试验结果分析（以产品收率为响应值）Table 3 Analysis results of orthogonal experiment on yield

图3 纯水加入方式对奥利司他结晶的影响Fig.3 Effects of pure water adding code on orlistat crystallization

3 结论

通过对奥利司他低温溶析结晶溶剂的考察，选择了甲醇/水为最佳的结晶体系，在此体系中结晶产品收率高、纯度好，晶体较好过滤，加入晶种可以显著提高结晶温度，改善产品质量。在此基础上，通过正交试验，考察了水的加入量、待结晶溶液浓度、搅拌转速和降温速度等因素对结晶的影响，并进一步明确了水的加入方式。最终确定了一条奥利司他结晶新工艺：按照2℃/h速率降温，初始奥利司他为30 g/L，水的加量为25%（体积分数），分2次加入，析晶前加入0.1%的晶种，搅拌转速250 r/min条件下，所得奥利司他晶体含量和收率最高。经HPLC检测，奥利司他含量可达98.6%，收率可达85.3%。本实验甲醇/水结晶条件的优化为奥利司他的精制除杂提供了一种有益的参考，对其工业化生产具有较强的指导价值。

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（责任编辑 荀志金）

Optimization of solvent-out crystallization conditions of orlistat at lower temperature

YAN Tongshun1，YANG Jinyan2
（1.National Engineering Research Center of Chiral drugs，Lunan Pharmaceutical Group Corporation，Linyi 276006，China；2.School of Life Science，Linyi University，Linyi 276000，China）

The crystallization of orlistat was studied by the single factor test and the orthogonal experiment design.Factors influencing the orlistat crystallization，such as solvent types，seed，the amount of water，the concentration of the solution，stirring speed and cooling speed were investigated.By static crystallization experiments，thecrystallization ofmethanol/waterasthe bestsystem and itsproportion were established.Also adding crystal seed can obviously improve the crystallization temperature of orlistat，as well as improving product purity and content.Based on single factor test，the orthogonal experiment design L9（34）was carried out with all dynamic factors in 50 L crystallization reactor，as well as further optimization of water addition.Results show that the highest orlistat crystal content and recovery were obtained.Under the optimal conditions，the rate of the cooling temperature was 2℃/h，the initial concentration of orlistat was 30 g/L，adding the amount of the solvent water was 25%（V/V），twice to add，the 0.1%seed by weight of orlistat was added before crystallization，the condition of stirring speed was 250 r/min.By HPLC analysis，orlistat content was 98.6%，and yield was 85.3%.

orlistat；solvent-out crystallization；diluent solvent；optimization

Q799

A

1672-3678（2015）01-0101-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.00.017

2013-12-16

国家科技支撑计划（2008BAI76B04）

闫同顺（1977—），男，山东昌乐人，工程师，研究方向：生化药物的提取、纯化，E-mail：13581069217@163.com