枇杷叶总三萜酸的微波辅助超声提取工艺

刘 曦，黄伯骏，韩 伟

（华东理工大学 中药现代化工程中心，上海 200237）

枇杷叶总三萜酸的微波辅助超声提取工艺

刘 曦，黄伯骏，韩 伟

（华东理工大学 中药现代化工程中心，上海 200237）

以枇杷叶为研究对象，采用微波辅助超声提取其中的三萜酸，并采用香草醛-高氯酸比色法进行分析，建立标准曲线。考察提取方式、浸泡时间、乙醇浓度、提取时间、液固比和超声功率等因素，得到微波辅助超声提取的优化工艺条件：提取方式为先微波后超声，无浸泡，乙醇体积分数为75%，超声功率为144 W，液固比为25mL/g，微波时间为180 s，超声时间为75min，由此得到的枇杷叶总三萜酸得率为9.994%，显著优于传统的中药提取方法。

枇杷叶；总三萜酸；微波辅助提取；超声提取

枇杷叶（Eriobobotryae Folium）为蔷薇科植物枇杷Eriobobotryae Folium（Thunb.）Lindl.的干燥叶，是一种常用的化痰止咳平喘药，味苦、性微寒，归肺经和胃经，其药用历史最早见于《名医别录》［1］。枇杷叶具有清肺、化痰、止咳和胃降逆止呕的功效，主要用于治疗肺热咳嗽、胃热呕逆、气逆气喘和烦热口渴等症状［2］。枇杷叶中含有多种有效成分，如三萜酸、黄酮、多糖、挥发油、鞣质及维生素等［3］。其中三萜酸是枇杷叶的主要活性成分，包含熊果酸、齐墩果酸、科罗索酸、桦木脂酸以及马斯里酸等［4-5］，本研究的目标组分是枇杷叶中的三萜酸，是一类天然的弱酸性五环三萜类化合物，难溶于水和石油醚，但可溶于乙醇、甲醇和丙酮等有机溶剂中［6］。临床药理研究发现，三萜酸具有抗炎镇痛［7］、保肝护肝［8］、降低血糖［9］、抗氧化［10］、抗抑郁［11］和抗肿瘤［12］等多种药理作用，具有很大的发展潜力和广阔的应用前景。

目前，三萜酸的提取方法主要有溶剂萃取法、热回流法、索氏提取法、生物酶提取法、超临界CO2提取法、超声辅助提取法和微波辅助提取法［13］等。传统的中药提取方法具有提取时间长、效率低和成本高等缺点。笔者所采用的微波辅助超声提取法，可以有效地将微波的选择性加热、受热均匀和热效率高的特点［14］与超声的空化作用、机械作用［15］结合起来，在枇杷叶三萜酸的提取过程中可以显著缩短提取时间，提高提取效率，从而有望得到得率更高的三萜酸产品，以有力推进中药新型提取方法联用的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要原料与试剂

枇杷叶（产地浙江），购于上海华宇药业有限公司；熊果酸对照品（纯度≥98%），购于上海同田生物有限公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸和无水乙醇，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

UV1900PC型紫外分光光度计，上海市亚研电子有限公司；ER-692型微波提取装置，中国电子器件工业总公司；SK3310HP型超声提取装置，上海市科导超声仪器有限公司；HH-4型智能数显恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限公司；101-0型恒温干燥箱，沪南电炉烘箱厂。

1.2 实验方法

1.2.1 提取方法

精密称定枇杷叶3.00 g置于250mL三口烧瓶，加入乙醇溶液，在微波装置中间歇提取，采用冷凝回流装置和空气鼓泡器进行冷却和搅拌，冷却后再置于超声波装置中提取，冰浴冷却后，减压抽滤，取滤液待测。

1.2.2 分析方法

采用香草醛-高氯酸比色法对枇杷叶中的总三萜酸含量进行分析。精密称取熊果酸标准品，配制成质量浓度为0.10 mg/mL的熊果酸标准品溶液。分别吸取熊果酸标准品和枇杷叶提取液，置于10mL具塞刻度试管中，挥去溶剂，加入体积分数5%香草醛-冰醋酸溶液0.5mL和高氯酸2.0mL，在60℃下加热15min后冷却，用冰醋酸定容至10mL，置于紫外-可见分光光度计中进行波长扫描，确定三萜酸的检测波长为545nm。

1.2.3 计算方法

依据1.2.2节中的分析方法对枇杷叶中总三萜酸物质进行检测，得到相应的吸光度值A，并利用标准曲线的回归方程计算出总三萜酸浓度，从而进一步计算得率

式中：ρ为样品中三萜酸的质量浓度，mg/mL；V为提取溶剂用量，mL；m为枇杷叶的质量，g；n为溶液稀释倍数。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的建立

采用熊果酸标准品溶液，以相应显色试剂作空白对照，在545nm的波长下进行检测，并以熊果酸质量浓度（ρ）为横坐标、吸光值（A）为纵坐标绘制标准曲线，结果如图1所示。

图1 熊果酸标准曲线Fig.1 The standard curve of ursolic acid

由图1可知：其线性回归方程为A=42.947ρ+ 0.011 8，线性浓度范围为 0.001 04～0.018 72 mg/mL，R2=0.999 5，说明熊果酸（总三萜酸）质量浓度ρ与吸光值A具有良好的线性关系。并且经过实验考察，具有良好的精密度、重现性和稳定性。

2.2 提取条件的影响

2.2.1 提取方式的考察

不同的提取方式决定了有效成分的溶出效果，对单独微波、单独超声、先微波后超声和先超声后微波4种提取方式进行比较研究，结果如图2所示。

从图2可以看出：微波与超声联用技术的提取效率优于单项技术，并且先微波后超声的提取效果优于先超声后微波。造成这种现象的原因可能是，虽然微波强烈的热效应和超声波的空化效应均会对细胞结构造成一定的破坏，但是前者的破坏作用强于后者，所以先进行微波提取有助于有效成分在后续提取过程中的进一步溶出，从而进一步提高总三萜酸的得率。

图2 不同提取方式对总三萜酸得率的影响Fig.2 Effect of extraction methods on yield of the total triterpenic acid

2.2.2 浸泡时间的影响

中药饮片一般为干燥的动植物组织，因其细胞失水而不利于药效成分的溶出，而对药材的浸泡在一定程度上可以有助于药效成分的溶出和提取。考察浸泡时间对总三萜酸得率的影响，结果如图3所示。

图3 浸泡时间对枇杷叶总三萜酸得率的影响Fig.3 Effects of soaking time on yield of the total triterpenic acid

由图3可知：单独浸泡时，浸出药液的三萜酸得率随时间延长先显著增大，而后趋于平缓；若先浸泡后提取，三萜酸的得率没有明显变化，相对标准偏差（RSD）＜5%。表明在单独浸泡时，一段时间的浸泡可以有助于目标产物的溶出。但在微波-超声提取法时，在提取之前的浸泡对于提高得率帮助不大，可能原因是微波辅助超声的提取方法对于枇杷叶三萜酸具有非常好的提取效果，相比之下，浸泡的效果则不是很明显。因此，本实验采取无浸泡、直接提取的方式。

2.2.3 乙醇体积分数的影响

在不同体积分数的乙醇溶液中，乙醇分子和水分子以不同强度的氢键缔合，这种缔合状态会影响药效成分的溶解度，从而影响其提取效果，考察乙醇体积分数对总三萜酸得率的影响，结果如图4所示。

图4 乙醇体积分数对枇杷叶总三萜酸得率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on yield of the total triterpenic acid

由图4可知：枇杷叶总三萜酸的得率随着乙醇体积分数的升高先增大后减小，在乙醇体积分数为75%时，三萜酸得率达到最大值，原因可能是三萜酸具有明显的亲脂性，所以不易溶于低浓度乙醇溶液；但是由于高体积分数乙醇会使胞内蛋白质凝固，形成传质阻力，不利于提取过程的进行。因此，本实验采用75%乙醇作为提取溶剂。

2.2.4 超声功率的影响

选择合适的超声功率有助于提高枇杷叶三萜酸的提取效率。笔者在SK3310HP型超声波清洗器可允许的超声功率范围内，考察了超声功率对三萜酸得率的影响，结果如图5所示。

由图5可以看出：当超声功率小于144 W时，总三萜酸得率随超声功率的增加而显著增大；当超声功率大于144 W时，三萜酸的得率基本不再增加。由此可知，超声功率的增大可促使三萜酸的提取速度加快，但是当超声功率达到一定值时，总三萜酸得率不再增加。因此，本实验选取144 W的超声功率用于枇杷叶的提取实验。

2.2.5 液固比的影响

液固比决定着液-固两相之间传质动力的大小，从而影响提取效率。分别考察不同液固比对三萜酸得率的影响，结果如图6所示。

图5 超声功率对枇杷叶总三萜酸得率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on yield of the total triterpenic acid

由图6可知：随着液固比的增大，提取溶剂的增加，三萜酸的得率先增大后减小，在液固比为25mL/g时达到最大值，原因可能是液固比的增大提高了提取溶剂与物料内部的浓度差，有利于有效成分的扩散和溶出，但当液固比过大时，降低了传热速率，过量的提取液也会增加生产成本，不利于提取液后续处理。因此，本实验采用的液固比为25mL/g。

图6 液固比对枇杷叶总三萜酸得率的影响Fig.6 Effect of liquid-solid ratio on yield of the total triterpenic acid

2.2.6 微波时间的影响

微波辐射时间的作用效果与药材质量、溶剂体积和微波功率密切相关，笔者在微波功率为650 W的条件下，分别考察不同微波辐射时间对三萜酸得率的影响，结果如图7所示。

由图7可知：在一定范围内三萜酸得率随着微波辐射时间的延长而显著增加，当微波时间超过180 s时，三萜酸得率不再增加，超过210 s时，三萜酸得率开始下降。这表明，适当延长微波时间有利于加快三萜酸的溶出，但过长的微波时间又会使药液中的三萜酸分解。因此，本提取过程中的微波辐射时间为180 s。

图7 微波时间对枇杷叶总三萜酸得率的影响Fig.7 Effect of microwave time on yield of the total triterpenic acid

2.2.7 超声时间的影响

超声时间也是影响三萜酸提取效率的重要因素，笔者分别对超声时间为15、30、45、60、75、90和105min的三萜酸提取效果进行考察，结果如图8所示。

由图8可知：三萜酸的得率随着超声时间的延长先增大而后减小，原因可能是随着超声时间的增加，三萜酸发生了一定程度的分解，并且过长的提取时间也会增加杂质的溶出，不利于后续纯化过程的进行。因此，本实验所选择的最佳超声时间为75min。

图8 超声时间对枇杷叶总三萜酸得率的影响Fig.8 Effect of ultrasonic time on yield of the total triterpenic acid

2.3 不同提取工艺的比较研究

将微波辅助超声提取三萜酸的工艺与其他提取方法进行比较，分别从提取时间、能源消耗和得率三方面进行考察，结果见表1。

通过表1中的比较可知：微波辅助超声提取枇杷叶三萜酸的得率最高，比单独超声提取高2.966%，比热回流提取高0.577%，比索氏提取高0.360%；而提取时间和能耗分别是单独超声提取的86.7%和98.4%，是热回流和索氏提取的43.3%和20.2%。综合考虑产品得率、提取效率与能耗，微波辅助超声提取工艺与其他方法相比具有较大的优势。

表1 不同提取方法的比较Table 1 The comparison of different extraction methods

3 结论

1）通过对枇杷叶总三萜酸的微波辅助超声提取工艺的考察可知：选择先微波后超声的提取方式，以切碎的枇杷叶为提取体系，以75mL的75%乙醇溶液为提取溶剂，对枇杷叶进行直接提取，先在微波发生装置中提取180 s，再置于功率为144 W、温度为60℃的超声提取装置中提取75min，三萜酸得率为9.994%。

2）通过对不同三萜酸提取方法的比较发现：由微波辅助超声提取所得的枇杷叶三萜酸得率分别比超声提取、热回流提取和索氏提取法提高2.966%、0.577%和0.360%，超声提取所需的时间是微波辅助超声提取法的1.2倍，而传统的提取方法（热回流提取和索氏提取）所需的提取时间和能耗分别是该方法的2.3和4.9倍。因此表明，微波辅助超声提取法具有高效、省时和低能的优点。

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（责任编辑 周晓薇）

Microwave and ultrasound-assisted extraction of total titerpenic acid from Eriobobotryae Folium

LIU Xi，HUANG Bojun，HAN Wei
（Engineering Center for Tradition Chinese Medicine Modernization，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）

Micronave and ultrasound-assisted extraction was developed to extract total triterperic acid in Eriobobotryae japonica.Standard curve was established with ultraviolet-visible spectrophotometry as detection method.Extraction methods，soaking time，ethanol concentration，extraction time，liquid-solid ratio and ultrasonic power were studied.The extraction process was optimized as follows：microwaveassisted extraction followed with ultrasonic extraction without soaking was chosen with ethanol concentration at 75%and liquid-solid ratio of 25mL/g.Microwave duration time was set to 180 s，and ultrasonic power at 144 W for 75min.The yield of the total triterpenic acid reached 9.994%.

Eriobobotryae Folium；triterpenic acid；microwave-assisted extraction；ultrasonic extraction

R284.2

A

1672-3678（2015）05-0052-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.05.010

2014-05-04

刘 曦（1989—），女，内蒙古包头人，硕士研究生，研究方向：中药制药工程；韩 伟（联系人），教授，E-mail：whan@ecust.edu.cn