无血清培养基干粉的生产工艺优化

翁志兵，邵春花，胡 辉

（1.上海中信国健药业股份有限公司，上海 201203；2.抗体药物国家工程研究中心，上海 201203；3.上海生物制造技术协同创新中心，上海 200237）

无血清培养基干粉的生产工艺优化

翁志兵1，邵春花1，胡 辉2，3

（1.上海中信国健药业股份有限公司，上海 201203；2.抗体药物国家工程研究中心，上海 201203；3.上海生物制造技术协同创新中心，上海 200237）

为了研究瞬时温度的提高对培养基加工的影响，通过不同的固定温度处理培养基，考察不同温度长时间处理后的培养基对CHO细胞的生长和表达的影响。结果表明，40℃处理后的效果最佳，处理工序与对照工艺相比，大大简化，产能有很大提升，为大规模生产培养基设备的选型和生产参数设置提供理论依据，且提高了设备的生产效率。

无血清培养基；温度；针磨

动物细胞培养多采用无血清培养基，无血清培养基长期被国外供应商垄断，国内生产无血清培养基的公司寥寥无几。由于培养基所需的大部分原料容易受潮，若不进行干燥处理，会对培养基的最终品质以及用量造成不利影响。因此，在培养基生产中，首先需要在一定温度下对原料进行干燥处理。在处理过程中，不同成分对温度的敏感程度各不相同，需要在不同的温度下进行处理，然后混合在一起，经过碾磨最终制成培养基干粉。国内现有的企业都是采用传统球磨方式，球磨虽然结构简单，但钢珠的清洗及搬运费时费力，效率低下，工作噪音大，占地面积大，增加了生产成本和生产时间。另外，球磨工艺采用的是批次生产，造成单批产能有限［1-2］。

国内抗体产业不断发展，规模越来愈大。如上海中信国健药业股份有限公司投资的亚洲最大30 000 L抗体项目将于2015年年底投产，必将增大对无血清培养基的需求。如果继续采用球磨方式会很大程度降低培养基的年产能。目前国际上已经有培养基公司采用先进针磨工艺，其优势在于能实现无血清培养基的连续生产，一台体量很小的针磨设备就可以与大型球磨机产能相当。但针磨工艺的缺点是设备高速旋转，产热量大；热交换面积小，导致传热效率低，对培养基的品质也会造成不利影响。同时，不同的工作温度对设备的产能影响很大［3-8］。因此，找到一个绩效比最高的生产温度就显得非常重要。目前，国内对培养基干粉温度处理的研究较少，对于针磨的使用缺乏实际经验。

针对针磨工艺导致瞬间温度提高影响培养基质量问题，笔者研究不同温度长时间处理的培养基干粉对CHO细胞培养和蛋白表达的影响，以确定绩效最高的处理温度。

1 材料与方法

1.1 材料

表达抗人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体的CHO细胞由上海中信国健药业股份有限公司提供，培养基生产原料由上海抗体药物国家工程研究中心有限公司提供。

1.2 培养基处理方法

设定4个温度点，分别为40、60、80和100℃，处理时间4 h（针磨设备物料接触极限值），以原方法处理的作为对照实验（RT）。每个温度点加2个平行试验，以消除实验误差可能带来的影响。

1.3 细胞培养方法

将细胞以1×106个/mL的初始细胞密度接种于1 L摇瓶中，载液量为400mL，培养时间为10 d，pH低于6.8补碱，每天补糖至3 g/L，温度为37℃，CO2体积分数为5%，转速为125r/min。每天取样计数，并将培养液于10 000r/min离心5min，保存上清液于-20℃冰箱，用于理化参数分析。

1.4 分析方法

1.4.1 细胞计数

每天取样利用台盼蓝拒染法染色，使用上海睿钰生物科技有限公司的Countstar自动细胞计数仪读取活细胞密度和细胞活率，每样计数3次，取平均值。

1.4.2 葡萄糖-乳酸测定方法

采用德国Labo公司全自动TRACE葡萄糖-乳酸分析仪检测乳酸和葡萄糖浓度，每一样品重复检测1次，取平均值。

1.4.3 蛋白表达量测定方法

色谱柱采用AB公司POROS®A20 Columns，2.1 mm×30 mm，系统采用Agilent1260 HPLC。流动相A：50 mmol/L磷酸缓冲液，0.1 mol/L NaCl，流动相B：0.1%HCl，0.1 mol/L NaCl，流动相A和流动相B的比例为3∶7；流速1mL/min；检测波长280nm；进样温度（5±3）℃；柱温（25±5）℃；进样量100μL。

1.5 统计方法

采用SPSS 19软件进行数据的统计分析。

2 结果与讨论

2.1 不同温度处理的培养基对活细胞密度的影响

研究不同温度处理的培养基对活细胞密度的影响，结果如图1所示。

图1 不同温度处理的培养基对活细胞密度的影响Fig.1 Effects of medium treated with different temperature on cell density

从图1可以发现，100℃时的活细胞密度最低，可能是由于培养基中的某些成分经过100℃高温处理后，会有部分损失，营养成分的减少影响了细胞的生长繁殖，造成了活细胞密度较低。在培养基磨制过程中，实际针磨工艺瞬时高温可达80℃以上，对热敏感物质有很大破坏，例如PF68（一种非离子型乙烯和环氧丙烷共聚物，被用作消泡剂和抗击细胞培养中剪切力的细胞膜稳定剂）就会熔化并结块。针磨处理培养基原料时间受设备处理能力和筛网大小影响，一般接触时间约为10～30min，因此，控制针磨腔体内部温度尤为重要，一般使用干冰或液氮降温。合理控温点可在节约成本的同时提高产能。从活细胞密度来看，40℃和对照组差异较小，基本相同，细胞活力较高。

2.2 不同温度处理的培养基对乳酸的影响

研究不同温度处理的培养基对乳酸的影响，结果如图2所示。

图2 不同温度处理的培养基对乳酸的影响Fig.2 Effects of medium treated with different temperatures on lactate concentration

从图2可以发现，100、80℃时的乳酸质量浓度较高，达到1.75 g/L以上，60℃时的乳酸浓度居中，40℃和对照组的乳酸浓度最低。乳酸浓度较高会抑制细胞的生长和表达，对比图1和图2可以看出，乳酸浓度较高的，活细胞密度相对较低。

培养基干粉处理温度较高时会对培养基成分造成一定影响，比如谷氨酰胺和转铁蛋白等［9-10］，这些成分与细胞生长和代谢相关，有可能是影响了三羧酸循环（TCA循环），能量代谢进入了糖酵解途径或者己糖磷酸支路（HMP）途径，乳酸浓度升高。乳酸浓度越低，说明能量代谢越彻底，释放的ATP越多，越有利于细胞生长和代谢，乳酸浓度高影响细胞能量代谢，进而抑制细胞生长和表达。因此，从乳酸浓度来看，40℃和对照组最优。

2.3 不同温度处理的培养基对目的蛋白表达量的影响

研究不同温度处理的培养基对目的蛋白表达量的影响，结果如图3所示。

图3 不同温度处理的培养基对表达量的影响Fig.3 Effects of medium treated with different temperatures on protein epression

从图3可以看出，100℃处理下的蛋白表达量最低，仅有2.06 g/L；40℃处理后的蛋白表达量和对照组蛋白表达量最高，分别达到2.45和2.53 g/L。其他温度处理下的蛋白表达量均低于40℃下的表达量。100℃时的蛋白表达量最低，可能是由于培养基中的部分成分经过100℃高温处理后，会有部分损耗，营养成分的减少影响了细胞代谢，造成了蛋白表达量较低。

2.4 单因素实验结果及方差分析

比较不同培养基培养10 d后活细胞密度、乳酸及其目的蛋白表达量，并进行方差分析，结果如表1和2所示。

表1 各组培养10 d后的活细胞密度、乳酸及其目的蛋白表达量的比较Table 1 Comparison of live cell density，lactate concentrate and the epression level of aim protein in different groups after 10 d′s culture（x±s）

表2 单因素实验方差分析Table 2 One-was analysis of variance

由表1和表2可知：100℃处理下的活细胞密度最低，40℃处理下的活细胞密度最高，其他温度处理下的活细胞密度与对照组比较均为显著性差异。40℃时，P＞0.05，为非显著性差异。40℃和对照组的乳酸浓度最低，浓度相差较小，非显著性差异，较为接近。从蛋白表达量来看，40℃和对照组为非显著性差异，其他组与对照组为显著性差异，明显高于其他处理温度时的蛋白表达量，因此，40℃和对照组最优。

3 结论

针对针磨工艺导致瞬间温度提高影响培养基质量问题，笔者研究不同温度长时间处理的培养基干粉对CHO细胞培养和蛋白表达的影响，以确定绩效最高的处理温度。综合乳酸浓度、活细胞密度和蛋白表达量来看，40℃和对照组的均优于其他组，其中对照组的乳酸浓度最低，蛋白表达量最高，但对照组的培养基干粉处理工序较为繁琐，生产效率较低。而40℃处理后细胞的生长状况和对照组为非显著性差异，但是处理工序却大大减少，生产效率得到大幅提高。综合考虑，40℃的培养基干粉针磨处理工序是最佳的处理温度。

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（责任编辑 管 珺）

Optimization of production process of serum-free medium

WENG Zhibing1，SHAO Chunhua1，HU Hui2，3
（1.Shanghai CP Guojian Pharmaceutical Ltd.，Shanghai 201203，China；2.National Engineering Research Center of antibody Medicine，Shanghai 201203，China；3.Shanghai Collaborative Innovation Center of Bio-Manufacturing Technology，Shanghai 200237，China）

In order to study instantaneous temperature's effects on serum-free medium，following limit experiments are designed，keeping the serum-free medium under different temperature for a long time to study the effects of medium under different temperature on the growth of CHO cells.The results show that 40℃ was the best temperature，it also reduces the procedure of medium manufacturing.It will provide a theoretical basis for the selection of medium producing equipment and production parameters，and improves production efficiency of the equipment.

serum-free medium；temperature；pin grinding

Q813

A

1672-3678（2015）05-0057-04

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.05.011

2014-08-25

上海市科学技术委员会科技支撑项目（12431901402）

翁志兵（1980—），男，江苏泰兴人，工程师，研究方向：无血清培养基及大规模动物细胞培养，E-mail：weng1980@sina.com