HPLC法测定薄荷苯酚软膏中苯酚含量＊

孙建华

薄荷苯酚软膏是由薄荷脑、苯酚、羊毛脂、凡士林按一定比例制成的制剂，具有止痒、消毒的功能。主要用于瘙痒性皮肤病、银屑病、神经性皮炎等，临床效果良好。现行质量标准为紫外分光光度法测定软膏中苯酚的含量。为精密控制产品质量，笔者采用高效液相色谱法测定薄荷苯酚软膏中苯酚的含量［1，2］。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪Agilent 1100；METTLER AE－240电子天平，超纯水器 SYNERGYUV－1（法国 MILLIPORE公司），紫外可见分光光度计UV－1100（上海精密仪器仪表有限公司）。薄荷苯酚软膏（批号：20131102、20131103、20131104）；苯酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号100509－201104）；甲醇为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB－C18（4．6mm×25 cm，5 μm）；流动相：甲醇－水（62∶38）；检测波长 271 nm；柱温 45℃；流速 1．0ml／min；进样量 10 μl。同时按《中国人民解放军医疗制剂规范》2002年版中薄荷苯酚软膏处方比例［3］同法制备缺苯酚的阴性样品，阴性样品在苯酚色谱峰位置处无相应色谱峰出现，苯酚与相邻峰的分离度＞6，理论板数按苯酚峰计算不低于10 000。见图1。

2．2 溶液制备

2．2．1 对照品溶液的制备 取苯酚约 4．5 g，精密称定，置于100m l量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1m l含苯酚45mg的储备液A。精密移取2m l储备液A置于100ml容量瓶中，加流动相定容，制成每1m l含苯酚900μg的储备液B。精密移取1m l贮备液B，置25m l量瓶中，加流动相制成每1m l含苯酚为36μg的对照品溶液，摇匀，即得。

图 1 苯酚色谱图

2．2．2 供试品溶液的制备 取供试品约0．5g（含苯酚约5mg），精密称定，置50m l量瓶中，加无水乙醇适量，于60℃下超声15min（功率660W，频率28 kHz），使充分溶解，放至室温用无水乙醇稀释至刻度，揺匀，置于冰浴中冷却2 h，取出后迅速滤过，放至室温，取续滤液10ml置25m l量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用0．22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2．2．3 阴性样品溶液的制备 按处方比例及制备工艺，配制不含苯酚的阴性样品，依2．22项下方法提取制备，作为阴性样品溶液。

2．3 线性关系考察 精密量取适量对照品储备液B，加流动相配制成含苯酚浓度为 9、18、36、72、180、360 μg／ml 6 组标准系列溶液。精密吸取各浓度标准系列溶液10μl，按2．1项条件进行测定。以峰面积为纵坐标（Y），标准系列溶液浓度为横坐标 （X）绘制标准曲线，得苯酚的回归方程为Y＝9．6376X＋8．2017，r＝0．9999 （n＝6）。 表明苯酚在 9～360 μg／ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2．4 精密度实验 精密吸取对照品溶液10μL，按“2．1”项下色谱条件，连续重复进样6次，记录峰面积值，RSD为0．14%。说明精密度良好。

2．5 重复性实验 取薄荷苯酚软膏6份 （批号20131102），按“2．2．2”项下制备方法制备分别制备6份供试品溶液，分别进样 10 μl，含量 RSD 为 0．23%（n＝6）。表明方法重复性良好。

2．6 供试品溶液稳定性试验 取薄荷苯酚软膏 （批号20131102），“2．2．2”项下制备方法制备，分别于 0、1、3、6、9 和12 h测定含量，苯酚含量RSD值为0．61%，表明供试品溶液中苯酚在12 h之内稳定。

2．7 回收率实验 取已知苯酚含量的薄荷苯酚软膏 （批号20131102）6 份，每份约 0．5 g，精密称定，每份分别精密加入储备液B溶液5m l，按2．22项下方法制备供试品溶液，在2．1条件下测定苯酚含量，计算加样回收率。平均回收率为103．6%，RSD为1．26%，表明该方法回收率良好。 见表1。

2．8 样品含量测定 取3批样品（批号：20131102、20131103、20131104），每批样品测定 2份，按2．22项下方法制备供试品溶液，在2．1色谱条件下测定，以外标法计算各个样品中苯 酚 的 含 量 ， 苯 酚 含 量 分 别 为 1．04%（g／g）、1．04%（g／g）、0．96%（g／g）。

3 讨 论

现有质量标准《中国人民解放军医疗制剂规范》2002年版中均为紫外分光光度法测定苯酚含量值，此操作方法误差性较大。本实验设计使用高效液相色谱法测定苯酚含量值，进一步提高了质量标准。实验中流动相（甲醇∶水）比例分别按 70∶30、62∶38、50∶50 测定，发现当比例为 62∶38 时，峰形对称，无拖尾，保留时间适宜，为4．7min，分析时间短，方法简便快速，且理论板数在4000以上。以流动相为溶剂，在190～400 nm波长范围内对苯酚进行紫外光谱扫描，发现在271 nm处有良好吸收，因此选定检测波长为271 nm；实验采用Agilent ZORBAX SB－C18（4．6 mm×25 cm，5 μm）、Agilent Eclipse Plus C8（4．6mm×250mm，5 μm）、Agilent ECLISPE XDB－C18（4．6mm×15 cm，5μm） 分别进行进样， 发现采用Agilent ZORBAX SB－C18柱子峰形较好，分离度高，无拖尾。

综上所述，HPLC法结果精确，设计合理、专属性强，方法学验证科学可靠，符合《中国药典》2010年版二部“药品质量标准分析方法验证指导原则”的要求［4］，可为进一步提高薄荷苯酚软膏的质量标准提供数据参考。

表 1 薄荷苯酚软膏中苯酚回收率试验测定结果（n＝6）

［1］荆凡波，程显隆，马双成，等．高效液相色谱法测定复方硼砂溶液中苯酚的含量［J］．药物分析杂志，2010，30（1）：28．

［2］杨 娟，黄敬群，李 红，等．高效液相色谱法测定复方樟脑搽剂中苯酚的含量［J］．中国医院药学杂志，2008，5（18）：92－93．

［3］总后卫生部．中国人民解放军医疗制剂规范［S］．北京：人民军医出版社，2002．153．

［4］国家药典委员会．中华人民共和国药典［S］．北京：中国医药科技出版社，2010．二部，附录ⅩⅨ A．