响应面法优化碱性蛋白酶提取瘤背石磺肌肉蛋白

刁　亚，沈和定，程知庆，姚理想，吴　欣，杜文俊

（上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海海洋大学水产与生命学院，上海201306）

响应面法优化碱性蛋白酶提取瘤背石磺肌肉蛋白

刁亚，沈和定*，程知庆，姚理想，吴欣，杜文俊

（上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海海洋大学水产与生命学院，上海201306）

以瘤背石磺肌肉为原料，蛋白提取率为指标，采用碱性蛋白酶提取瘤背石磺肌肉中的蛋白。在单因素实验的基础上，通过响应面法考察温度、pH、时间和液固比对蛋白提取率的影响，优化碱性蛋白酶酶解反应的工艺条件。结果表明，响应面法得到的最佳工艺条件合理可行，最佳工艺条件为温度56℃，pH12.6，时间3.2 h，液固比93 mL/g。在上述条件下，蛋白提取率的预测值为18.36%，实际值为18.30%，两者相对误差0.34%，表明此模型合理可行。

瘤背石磺，碱性蛋白酶，提取，响应面

瘤背石磺（Onchidium struma）在江苏沿海及上海又名土海参、海癞子、土鸡等［1］，是软体动物门（Mollusc）腹足纲（Gastropoda）肺螺亚纲（Pulmonata）缩眼目（Stylommatophora）石磺科（Onchidiidae）的一种生物。瘤背石磺的身体表面分布着许多瘤状突起，背部中间有一背眼，可以自由的伸缩，触角顶端的眼没有感光作用，是一种介于海洋和陆地之间的过渡带海洋软体动物［1］。

从20世纪80年代中期开始，一些专家开始研究瘤背石磺的营养价值，管菊等［2］发现瘤背石磺肌肉蛋白含量高达59%，黄金田等研究表明瘤背石磺中人体必需氨基酸的含量较高，而其中谷氨酸和甘氨酸的比例为6.51%和4.77%［3］，瘤背石磺肌肉蛋白的营养价值优于其他动物蛋白，使瘤背石磺在药物和保健品开发中具有广阔应用前景［4］，所以合理利用瘤背石磺可溶性蛋白质具有很高的经济价值。近年来许多研究学者采用酸法［5-6］、碱法［7-8］和酶法［9-12］提取动物蛋白，进一步分离纯化得到活性肽。其中酶法过程条件容易控制，反应条件温和，成本低，效率高，是目前生产和科学研究中使用最广泛的一种方法。蒋海萍等［13］比较了五种蛋白酶提取蓝圆鯵蛋白的效果，选择碱性蛋白酶作为制备蓝圆鲹蛋白抗氧化肽的最佳蛋白酶。聂新艳等［14］采用胰蛋白酶提取鸡爪外皮中的蛋白质，通过响应面优化得到的最佳工艺条件为预处理蒸煮时间为2 h、pH8.0、提取时间5 h、提取温度46℃、加酶量100 U/g、液料比（v/w）为40∶1。祝海娟等［15］利用响应面法优化碱性蛋白酶提取大麦虫蛋白的工艺，最佳条件为加酶量（E/S）5%、pH12、料液比1∶20 g/mL、提取温度50℃、提取时间2.5 h，在此条件下得到大麦虫蛋白的提取率为86.96%，大麦虫蛋白含量75.01%。

本实验以瘤背石磺肌肉为原料，采用碱性蛋白酶进行水解，考察不同的提取条件（温度、pH、时间、液固比、加酶量）对蛋白提取率的影响，并利用响应面法优化工艺条件，为酶法提取瘤背石磺肌肉蛋白提供理论依据，同时也为瘤背石磺资源利用提供重要参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

瘤背石磺2014年7月采于上海崇明岛滩涂，经上海海洋大学沈和定教授鉴定为瘤背石磺，平均体重为（17.81±3.29）g；胰蛋白酶（酶活力4.2×103U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力4.3×104U/g）、胃蛋白酶（酶活力1.2×103U/g）国药基团化学试剂有限公司；中性蛋白酶（酶活力2.1×104U/g）、碱性蛋白酶（酶活力2.0× 105U/g）北京奥博星生物技术有限责任公司；无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、石油醚、磷酸、碳酸钠、酒石酸钾钠、硫酸铜等均为分析纯。

K12A型全自动定氮仪上海晟声自动化分析仪器有限公司；HWS-26型双列六孔恒温水浴锅上海慧泰仪器制造有限公司；AL104型电子分析天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UB-7 pH计梅特勒公司；DHG-9077A型电热恒温干燥箱上海精宏实验设备有限公司；QSJ-D162型组织切碎机广东小熊电器有限公司；TDZ6B-WS型低速台式离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；UV-7502PC型紫外可见分光光度计上海精密仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1样品制备将瘤背石磺解剖后取出内脏，剩余肌肉组织用清水洗净后装袋，密封置于-80℃超低温冷冻备用。

1.2.2粗蛋白含量测定粗蛋白测定采用微量凯氏定氮法（GB/T5009.5-2010），测得瘤背石磺肌肉粗蛋白含量为62.14%，与管菊等［3］的研究结果基本一致，表明瘤背石磺肌肉蛋白含量较多。

1.2.3水溶性蛋白测定采用考马斯亮蓝法［16］，蛋白提取率（%）=水解液中水溶性蛋白的含量/样品粗蛋白的含量×100。

1.2.4瘤背石磺外套膜蛋白的酶解工艺冷冻瘤背石磺→解冻（4℃蒸馏水冲洗）→洗净，沥干→搅碎→石油醚去脂→乙醇洗涤→离心取沉淀物（4000 r/min，15 min）→40℃干燥12 h→沉淀物放入三角烧瓶→加入水（水与底物的质量比以下称液固比）→调节pH和温度→加入蛋白酶→酶解（酶解过程不断调节pH）→沸水浴10 min灭酶→离心分离取上清液（4000 r/min，15 min）→测定提取率。

1.2.5蛋白酶的选择选用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和碱性蛋白酶五种酶，按照文献报道的最适作用条件［17-19］，比较这几种酶对瘤背石磺肌肉蛋白的作用效果，表1为蛋白酶筛选条件。用考马斯亮蓝法测定并计算蛋白提取率。

表1　蛋白酶的筛选Table 1　Screening of protease

1.2.6单因素实验在时间2 h、pH12.0、液固比100∶1（mL/g）、加酶量5%的条件下，调整温度为45、50、55、60、65、70℃，进行单因素实验，考察温度对蛋白提取率的影响。

在温度50℃、时间2 h、液固比100∶1（mL/g）、加酶量5%的条件下，调整pH为11.0、11.5、12.0、12.5、13.0和13.5，进行单因素实验，考察pH对蛋白提取率的影响。

在温度50℃、pH12.0、液固比100∶1（mL/g）、加酶量5%的条件下，调整时间为1、2、3、4、5和6 h，进行单因素实验，考察时间对蛋白提取率的影响。

在温度50℃、时间2 h、pH12.0、加酶量5%的条件下，调整液固比为50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1和100∶1（mL/g）进行单因素实验，考察液固比对蛋白提取率的影响。

在温度50℃、时间2 h、pH12.0、液固比100∶1（mL/g）条件下，调整加酶量为5%、6%、7%、8%、9%和10%，进行单因素实验，考察加酶量对蛋白提取率的影响。

1.2.7响应面实验设计综合单因素实验的结果，对碱性蛋白酶酶解工艺进行响应面实验设计，选取温度、pH、时间和液固比4个因素进行Box-Beknhen中心组合实验设计，实验因素和水平设计见表2。

表2　响应面实验因素水平编码表Table 2　Factors and levels of response surface experiences

1.2.8数据分析每个实验点平行三次，用Excel数据处理软件求出平均值和标准误差。用SPSS分析软件进行单因素方差分析和显著性检验，利用Design expert 8.0.5.0软件进行响应面数据分析。

2　结果与分析

2.1蛋白酶的酶解效果比较

五种酶对瘤背石磺肌肉蛋白提取效果如图1。

从图1中可以看出碱性蛋白酶对瘤背石磺蛋白的提取效果最好，提取率可达15.47%；胃蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的提取率分别为12.32%、11.81%、9.05%和8.33%。五种蛋白酶的提取率大小依次为碱性蛋白酶＞胃蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶。实验结果表明，瘤背石磺肌肉蛋白在较强酸性或较强碱性条件下易被水解，由于瘤背石磺的肌肉蛋白在普通条件下很难水解，而强酸和强碱打开了瘤背石磺肌肉蛋白的二级结构，使其更容易被水解。碱性蛋白酶是一种由地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）产生的、具有广泛底物特异性的丝氨酸型内切蛋白酶［20］，现已成功用于青鱼［21］、金枪鱼［22］等鱼蛋白的水解。因此后续实验采用水解效果更好的碱性蛋白酶进行进一步研究。

2.2单因素实验结果

2.2.1温度实验结果由图2可以看出，在温度为45～55℃时，随着温度的提高，提取率增加，因为蛋白分子的热运动开始加强，平均动能增高，酶与底物接触的几率不断提高，底物的结构也逐渐被打开。在55℃时蛋白提取率达到最大值，为14.8%，而温度继续升高，酶的稳定性受到影响，蛋白开始变性，酶的活性降低，蛋白提取率开始下降，因此最适温度为55℃左右。这与石岭等［23］在碱性蛋白酶酶解草鱼蛋白质的研究中得到的最适温度一致。

图1　不同蛋白酶对瘤背石磺肌肉蛋白酶解效果Fig.1　The influence of different proteases on Onchidium struma mantle protein extraction

图2　温度对瘤背石磺肌肉蛋白提取率的影响Fig.2　Influence of temperature on Onchidium struma mantle protein extraction rate

2.2.2pH实验结果由图3可以看出，当pH在11.0～12.5时，酶空间的构象随着pH的变化而改变，从而影响酶蛋白分子中心的活性催化基团与结合基团的功能［24］，在pH为12.5时，酶的活性最强，因此蛋白提取率也最大，而继续提高pH，酶的活性受到损失，甚至变性失活，蛋白提取率开始下降。这与徐鸿雁等［25］在蛹虫草多肽的制备及分离研究中，发现碱性蛋白酶的最适pH12.0相类似。

图3　pH对瘤背石磺肌肉蛋白提取率的影响Fig.3　Influence of pH value on Onchidium struma mantle protein extraction rate

2.2.3时间实验结果时间对蛋白提取率的影响如图4。

图4　时间对瘤背石磺肌肉蛋白提取率的影响Fig.4　Influence of enzymolysis time on Onchidium struma mantle protein extraction rate

由图4可知，当时间在1～3 h时，碱性蛋白酶持续水解底物，蛋白提取率不断上升，酶解3 h，提取率达到最高，而时间继续延长，由于酶解反应基本完成，溶液达到了平衡状态，溶液中的小肽和氨基酸开始增加［26］，导致蛋白提取率反而开始下降。这与刘淳等［27］在碱性蛋白酶酶解蚕豆蛋白的研究中，碱性蛋白酶的最佳时间3 h相同。

2.2.4液固比实验结果由图5可以看出，蛋白提取率随着液固比的增加呈先上升后下降的趋势，由于液固比较低时溶液的黏度较大，分子的扩散速度较慢，因此提取率较低，随着液固比的增加，分子扩散速度提高，酶与底物的接触机会提高，提取率提高，在90∶1 mL/g时，蛋白提取率达到最大值，而液固比继续增加，由于底物量变少，随着溶剂的增加导致酶与底物接触几率降低，从而导致提取率下降。

2.2.5加酶量实验结果酶添加过少，会影响酶解的效果，而酶添加过多，又会造成材料浪费和成本的提高，因此必须确定经济合理的加酶量。由图6可知，加酶量为5%～9%时，随着酶浓度的增加蛋白提取率提高，而继续添加酶会造成提取率的降低，这可能是因为酶开始催化水溶性蛋白的丝氨酸部位，产生小分子肽和氨基酸，造成蛋白提取率的下降［28］。因此为了生产考虑，选用9%的加酶量。这与唐宁等［29］在碱性蛋白酶制备玉米抗氧化肽的研究中，通过响应面法优化得到的8%最适加酶量相类似。

图5　液固比对瘤背石磺外套膜蛋白提取率的影响Fig.5　Influence of liquid-solid rate on Onchidium struma mantle protein extraction rate

图6　加酶量对瘤背石磺肌肉蛋白提取率的影响Fig.6　Influence of enzyme amount on Onchidium struma mantle protein extraction rate

2.3响应面设计最佳条件分析

2.3.1响应面优化因素选择用SPSS对各个单因素进行显著性方差分析，选择对瘤背石磺肌肉蛋白提取率影响较大的几个因素进行响应面优化实验。通过比较可以得出温度（A）、pH（B）、时间（C）和液固比（D）对瘤背石磺肌肉的提取率影响较大，选择这四个因素进行响应面优化实验，其他因素取单因素实验中的最佳水平。

2.3.2响应面优化实验设计及结果利用Design-Expert 8.0.5.0软件对表3数据进行多元回归拟合，得到蛋白提取率对温度、pH、时间和液固比四个因素的二次多项回归模型为：

Y=-640.32733+6.94523A+62.32167B+2.63933C+ 1.44330D+0.10000AB+0.03450AC+5.80000×10-3AD+ 0.09500BC-0.05600BD+0.04300CD-7.92570×10-2A2-2.49567B2-1.52017C2-6.45167×10-3D2

表3　响应面实验设计与结果Table 3　Design and results of response surface experiences

对上述模型进行进行方差分析，结果见表4。

由表4可知：回归模型的p＜0.0001，说明模型极显著，失拟项p=0.0872，不显著（p＞0.05），并且该模型的确定系数R2为0.9721，模型的调整确定系数R2Adj为 0.9441，说明此模型与实际拟合很好。

方差分析结果还表明，方程的一次项A、B、C、D影响极显著（p＜0.01），交互项CD影响显著（p＜0.05），二次项A2、B2、C2、D2影响极显著（p＜0.01），由此可见，温度、pH、时间、液固比对响应值都有显著影响。

方差分析中各因素的F值可以反映各因素对于实验指标的影响大小，F越大，影响效果越大。从表4可知，FA（34.58）＞FC（29.49）＞FB（15.00）＞FD（11.85），因此各因素对于瘤背石磺外套膜蛋白提取率的影响大小顺序依次是：温度＞时间＞pH＞液固比。

2.4响应面曲面分析及因素交互影响

通过上述方差分析的结果，仅有时间和液固比之间的交互作用有显著性，做出交互项的3D曲面图，如图7所示。

由图7可知，响应面3D图为开口向下的椭圆形曲面，当时间一定时，蛋白提取率随着液固比的增加呈现先增加再减少的趋势；而当液固比一定时，蛋白提取率随着时间的增加也同样呈现出先升高后降低的趋势，说明无论时间过长或过短，液固比过大或过小都会对蛋白提取率造成一定的影响。从等高线呈椭圆可以看出时间与液固比的交互作用对蛋白提取率的影响较显著，另外等高线沿时间轴向较液固比轴向密集，说明时间对蛋白提取率的液固比的影响大，等高线中心点为两者的最优值。

2.5验证实验

利用Design Expert 8.0.5.0软件对实验模型进行分析，得到的最优工艺为：温度55.88℃，pH12.62，时间3.21 h，液固比92.86 mL/g。在此条件下瘤背石磺肌肉蛋白提取理论值为18.36%。考虑到实际需要，对上述最优工艺进行调整，确定最优工艺为：温度56℃，pH12.6，时间3.2 h，液固比93 mL/g，在此条件下进行验证实验，3次平行实验得到的瘤背石磺外套膜蛋白的实际平均值为18.30%，与模型的理论预测值（18.36%）较为接近，相对误差为0.34%。

表4　回归方程方差分析表Table 4　Analysis results of regression and variance

图7　时间和液固比的交互作用对蛋白提取率的影响Fig.7　Response surface plots for the interactions effect of enzymolysis time and liquid-solid rate on the extraction rate of protein

3　结论

本实验在单因素的基础上，分析了碱性蛋白酶对于瘤背石磺外套膜的提取效果，并进行响应面实验设计，优化提取工艺条件。结果表明：影响碱性蛋白酶提取瘤背石磺外套膜蛋白的主要因素是温度，其次是时间与pH，最后是液固比。根据回归方程得到的最优工艺为：温度56℃，pH12.6，时间3.2 h，液固比93 mL/g，在此条件下得到最佳的蛋白提取率，提取率为18.30%。说明该模型可以很好地预测瘤背石磺外套膜蛋白提取条件与提取率之间的关系，同时也证明了响应面法优化提取工艺的可行性，从而为进一步研发瘤背石磺提供了理论依据。

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Optimizing conditions for alkaline protease extraction of Onchidium struma mantle protein by response surface methodology

DIAO Ya，SHEN He-ding*，CHENG Zhi-qing，YAO Li-xiang，WU Xin，DU Wen-jun
（Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Shanghai Ocean University，Ministry of Education，Shanghai 201306，China）

The effect of alkaline protease on the rate of protein extraction of Onchidium struma mantle were studied. Then the enzymolysis conditions of alkaline protease were optimized by using response surface method（RSM）on the basis of single factor as temperature，pH value，time，liquid-solid rate and enzyme amount experiments. The results showed that the optimum enzymolysis conditions were optimized as following：temperature 56℃，pH value 12.6，time 3.2 h，liquid-solid rate 93 mL/g respectively.Under these conditions，the predicted protein extraction rate was 18.36%，compared to the measured value 18.30%，the relative error was 0.34%.Results showed that the conditions were reasonable and feasible.

Onchidium struma；alkaline protease；extration；response surface methodology

TS254.1

A

1002-0306（2015）16-0227-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.038

2014－12－03

刁亚（1990-），男，硕士研究生，研究方向：海洋生物资源研究与开发，E-mail：diaoya2012@163.com。

沈和定（1964-），男，博士，教授，研究方向：贝类增养殖及海洋生物资源利用，E-mail：hdshen@shou.edu.cn。

国家自然科学基金项目（41276157）；上海高校水产学一流学科建设项目资助。