巨尾桉叶、皮、芯中单宁提取及其抗氧化性研究

周　洲，龙凤香，邓黎娟，韦婷馨，郑燕菲，刘雄民

（广西大学化学化工学院，广西南宁530004）

巨尾桉叶、皮、芯中单宁提取及其抗氧化性研究

周洲，龙凤香，邓黎娟，韦婷馨，郑燕菲，刘雄民*

（广西大学化学化工学院，广西南宁530004）

采用加热回流与超声波辅助提取法分别提取了巨尾桉的树叶、树皮、树芯3部位中的单宁，考察了3部位提取物的抗氧化特性。加热回流法提取巨尾桉树叶、树皮、树芯单宁的得率分别为4.19%、1.86%和0.25%。超声波辅助提取法提取巨尾桉树叶、树皮、树芯单宁的得率分别为3.20%、2.25%和0.19%。巨尾桉3部位的单宁提取物对DPPH·、·OH自由基和H2O2均有较好的清除作用，其中，巨尾桉叶、皮、芯单宁提取物对DPPH·自由基清除率分别相当于VC的91.08%、93.20%、79.40%；对·OH自由基清除率分别相当于VC的181%、125%、132%；对H2O2的清除率分别相当于VC的83.60%、65.46%、78.46%。

巨尾桉，单宁，提取，抗氧化

桉树，桃金娘科，又名尤加利树，树种繁多可达900多种，是我国南方地区大量种植的速生树种之一，而广西桉树面积、木材产量均居全国首位。其中，巨尾桉是巨桉和尾叶桉的杂交树种，由于其生长周期短，被广泛种植。但是对于巨尾桉的运用却较为单一，大多取用其木材，这就造成了资源的极大浪费。

近年来，桉树及其副产物的综合利用受到国内外研究者的关注，其中桉树挥发性芳香油、黄酮类化合物、酰基间苯三酚衍生物、非挥发性萜类及其苷类、鞣质等活性物质等研究已经取得一定进展。其中，田玉红［1-2］研究了大叶桉、巨尾桉、邓恩桉、赤桉等14种桉树的挥发油成分和挥发油提取工艺，并对生物活性进行了深入研究。陈海等［3］对桉叶抗氧化物的提取与抗氧化性的研究，证明桉叶提取物中酚类物质的含量与抗氧化成正比。黄增等［4-5］提取了巨尾桉叶挥发油、皂苷和单宁，并研究了其活性，其中巨尾桉叶单宁的提取得率为4.01%，对8种常见菌株有很好的抑制作用以及对DPPH·、·OH自由基和H2O2有很好的清除能力。郑燕菲等［6］从巨尾桉叶中提取得总黄酮，并考察了提取物对DPPH自由基的清除能力以及对食品中常见的腐败菌和产毒素菌的抑制作用。国内外的许多研究都表明［6-12］，桉树具有极高的经济价值和市场价值，其未来的发展前景很广，同时随着植物单宁研究的深入，单宁在医药、食品、制革工业、日用化工、矿石浮选等方面表现出越来越重要的作用。但有关巨尾桉树中单宁、特别是树皮和芯材的提取和抗氧化性还没有受到足够重视，其经济价值没有得到充分的发挥。

本文为了充分利用巨尾桉树叶、树皮、树芯资源，开展从树叶、树皮、树芯3个不同部位提取具有生物活性的单宁，比较不同提取方法、不同部位单宁含量的差异，考察其抗氧化活性，以期为综合利用速生桉资源提供理论依据和数据支持。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

巨尾桉树叶、树皮、树芯均采摘于广西大学西校园；单宁酸广东光华化学厂有限公司，分析纯；石油醚广东光华化学厂有限公司，分析纯；福林酚试剂上海宝曼生物科技有限公司，分析纯；饱和碳酸钠天津市北方天医化学试剂厂，分析纯；二苯基苦基肼自由基日本和光纯药工业株式会社，分析纯；抗坏血酸上海试四赫维化工有限公司，分析纯；硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、氢氧化钠广东光华化学厂有限公司，分析纯；磷酸二氢钾国药集团化学试剂有限公司，分析纯。

FZ102型微型植物粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；AR224CN型电子天平OHAUS国际贸易有限公司；电热恒温鼓风干燥箱上海跃进医疗器械厂；KQ-600DB型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；Agilent 8453E紫外-可见分光光度计安捷伦科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1样品预处理将巨尾桉的树皮、树叶和树芯洗净晾干，放于烘箱（40～45℃）中烘干，粉碎，过40目筛，用石油醚（料液比1∶4）在90℃油浴下回流4 h以脱色除脂，除去溶剂，置烘箱45℃干燥40min，于密封袋中储存备用［6］。

1.2.2标准曲线绘制精确称取0.0114 g单宁酸，溶解并定容至100 mL，得浓度为0.114 g/L的单宁酸标准液；依照Folin-Denis比色法［3］，分别移取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL的单宁酸标准液于棕色容量瓶中，各加入1.3 mL福林酚试剂，静置6 min后加入5.0 mL饱和Na2CO3溶液，静置6 min，定容至25 mL，摇匀，静置30 min，于756 nm波长测定吸光值。以单宁酸浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线，以最小二乘法计算，拟合线性方程。

1.2.3单宁提取实验考察以水为提取溶剂，加热回流和超声辅助提取两种方法提取巨尾桉三部位的单宁，比较得率。

1.2.3.1加热回流法提取单宁参考文献［13］方法并进行修改，分别称取树皮、树叶、树芯干粉各5.0 g于250 mL圆底烧瓶中，以1∶30的料液比加入蒸馏水，80～90℃油浴回流2 h，取提取液于4200 r/min下离心15 min，抽滤，50℃旋蒸浓缩，40℃干燥得提取物。

1.2.3.2超声辅助法提取单宁参考文献［5］方法并进行改进，分别称取树皮、树叶、树芯干粉各5.0 g于200 mL具塞锥形瓶中，以1∶15的料液比加入蒸馏水，以540 W，40～50℃超声提取2次，每次30 min，合并提取液，4200 r/min下离心15 min，抽滤，50℃旋蒸浓缩，40℃干燥得提取物。

1.2.4单宁提取物的抗氧化性能测定

1.2.4.1对二苯基苦基肼自由基（DPPH·）清除作用分别取2 mL不同浓度的巨尾桉叶、皮、芯单宁提取物和VC样液于刻度试管，依次加入2 mL浓度为3.10× 10-4mol·L-1的DPPH乙醇溶液，混合均匀，避光静置20 min，在紫外吸收波长524 nm处测定混合液的吸光值，记作Ai；依照上述步骤以相应体积的蒸馏水替换样液时测得的吸光值记作A0；用VC溶液做参比。

DPPH·自由基清除率的计算公式如下：

清除率（%）=（1-Ai/A0）×100

1.2.4.2对羟基自由基（·OH）清除作用分别移取2 mL不同浓度的巨尾桉叶、皮、芯单宁提取物和VC样液，依次加入9 mmol·L-1的FeSO4溶液2 mL、9 mmol·L-1的H2O2溶液2 mL，均匀混合静置10 min，再加入9 mmol·L-1的水杨酸溶液2 mL，静置10 min，在紫外吸收波长512 nm处测定混合液的吸光值，记作Ai；根据上述步骤以相应体积的蒸馏水替换水杨酸时测得的吸光值记作Aj；空白对照组以蒸馏水替换样液测得吸光值A0，以VC溶液做参比。

·OH自由基清除率的计算公式如下：

清除率（%）=［1-（Ai-Aj）/A0］×100

1.2.4.3对过氧化氢（H2O2）清除作用用pH=7.4的磷酸缓冲液配制10 mmol·L-1的H2O2溶液，分别移取2 mL不同浓度的巨尾桉叶、皮、芯单宁提取物和VC样液于具塞刻度试管中，再加入2 mL H2O2溶液，混匀静置10 min，在紫外吸收波长230 nm处测定混合液的吸光值，记作Ai；以上述步骤中不加H2O2溶液时测得的吸光值记作Aj；以上述步骤中不加样品溶液时测得的吸光值记作A0，以抗坏血酸溶液做参比。

H2O2清除率计算公式如下：

清除率（%）=［1-（Ai-Aj）/A0］×100

2　结果与讨论

2.1单宁酸和巨尾桉单宁光谱特性及其标准工作曲线

图1　巨尾桉单宁提取物与单宁酸光谱图Fig.1　Visible absorption spectrum of tannins and sample solutions

为了定量分析巨尾桉单宁含量，首先建立合适的分析方法，为此，考察巨尾桉单宁提取物与单宁酸的光谱特性。巨尾桉3部位单宁提取物、单宁酸的紫外-可见光谱图如图1所示。

由图1看出，巨尾桉单宁提取物与单宁酸具有相似的光谱特征，因此，可以采用单宁酸作为标准品建立定量分析方法。

以单宁酸浓度为横坐标，对应吸光值为纵坐标，绘制标准曲线如图2所示。所得线性方程为y=111.65x+ 0.1757，式中，y为吸光值，x为单宁酸浓度（mg/mL）；线性相关系数R2=0.9941，单宁浓度在0.002～0.02 mg/mL范围内于756 nm处吸光值关系良好。

图2　单宁酸标准曲线Fig.2　Standard curve of tannins

2.2单宁含量的测定

不同方法提取得到的树叶、树皮、树芯单宁提取物得率的结果如表1所示。

表1　不同方法对巨尾桉各部位中单宁提取的得率（%）Table 1　The yields（%）of the different parts in Eucalyptus Grandis x E.Urophylla by different methods

由表1可知，加热回流法提取巨尾桉叶单宁的得率为4.19%，稍高于文献［5］值4.01%。两种提取方法中，三个部位单宁提取率高低顺序均为：树叶＞树皮＞树芯。对于树叶和树芯而言，加热回流提取得率比超声辅助提取得率高；而对于树皮是超声辅助提取得率高于加热回流法。这可能是树叶、树芯和树皮中所含单宁的种类不同所致［14-16］。

（1）规范统一。应用移动终端实现无纸化操作、规范合同结算业务单据，从技术角度保证业务单据的真实性、准确性。

2.3单宁提取物抗氧化性能研究

2.3.1对DPPH·自由基清除作用巨尾桉树叶、树皮、树芯中单宁提取物和VC对DPPH·自由基清除效果见图3。由图3可以看出，树叶、树皮、树芯单宁提取物和VC对DPPH·自由基均有一定的清除能力，对自由基的清除能力在一定范围随着反应体系溶液浓度的增大而逐渐增强，并呈现一定的量效关系，当达到一定的浓度时清除率增加趋于平衡。

在样液浓度约为0.05 mg/mL时，各样液的清除率趋于平衡，树叶单宁提取物对DPPH·自由基的最大清除率为86.07%；树皮单宁提取物对DPPH·自由基的最大清除率为88.07%；树芯单宁提取物对DPPH·自由基的最大清除率为75.03%。与VC对DPPH·自由基的最大清除率94.50%相比，巨尾桉叶、皮、芯单宁提取物对DPPH·自由基清除率分别相当于VC清除率的91.08%、93.20%、79.40%。

比较各试样的IC50值可知，其清除作用大小依次为：VC＞树叶单宁提取物＞树皮单宁提取物＞树芯提取物，也就是说桉树三部位单宁提取物对DPPH·自由基的清除能力均弱于VC，这是因为提取物的清除能力与单宁含量大小有关。

2.3.2对·OH自由基的清除作用巨尾桉树叶、树皮、树芯中单宁提取物和VC对·OH自由基清除作用如图4所示。

图3　不同样液对DPPH·自由基的清除作用Fig.3　DPPH·free radical scavenging activity of different samples

图4　不同样液对·OH自由基的清除作用Fig.4·OH free radical scavenging activity of different samples

由图4可知，树叶、树皮、树芯单宁提取物和VC对·OH自由基均有一定的清除作用，在一定的浓度范围内，各试液对·OH自由基的清除能力随着各试样浓度的增大而增强，且当浓度增大到一定值时，样液对·OH自由基的清除作用有逐渐平稳的趋势；在样液浓度约为0.2 mg/mL时，各样液对·OH自由基的清除作用趋于平缓，巨尾桉叶、皮、芯单宁提取物对·OH自由基的最大清除率分别为62.43%、85.35%、59.00%；与VC对·OH自由基的最大清除率47.21%相比，巨尾桉树皮、芯、叶对·OH自由基清除率分别相当于VC清除率的181%、125%、132%。

2.3.3对H2O2的清除作用巨尾桉树叶、树皮、树芯中单宁提取物和VC对H2O2清除作用如图5所示。

图5　不同样液对H2O2的清除作用Fig.5　H2O2scavenging activity of different samples

由图5可知，树叶、树皮、树芯单宁提取物和VC对H2O2均具有一定的清除作用，在实验浓度范围内，桉树各部位单宁对H2O2的清除率均随着浓度的增大而升高，且在浓度增到一定值后清除率趋于稳定。当样液浓度大于0.07 mg/mL时，各样液的清除率增加缓慢，树叶单宁提取物对H2O2的最大清除率为51.84%；树皮单宁提取物对H2O2的最大清除率为62.13%；树芯单宁提取物对H2O2的最大清除率为66.20%；与VC对H2O2的最大清除率79.19%相比，巨尾桉树叶、皮、芯单宁提取物对H2O2清除率分别相当于VC清除率的83.60%、65.46%、78.46%。以试样的IC50值作为清除能力的比较，其顺序为VC＞树芯单宁提取物＞树叶单宁提取物＞树皮单宁提取物。可知巨尾桉3部位单宁提取物对H2O2的清除能力均弱于VC，但在小于0.024 mg/mL浓度时，巨尾桉3部位单宁提取物对H2O2的清除能力是高于VC的清除能力的。

3　结论

3.1用加热回流与超声波辅助提取法提取了巨尾桉的树叶、树皮、树芯3部位中的单宁，加热回流法提取巨尾桉树叶、树皮、树芯单宁的得率分别为：4.19%、1.86%和0.25%。超声波辅助提取法提取巨尾桉树叶、树皮、树芯单宁的得率分别为：3.20%、2.25%和0.19%。

3.2巨尾桉叶、皮、芯的单宁提取物对DPPH·、OH·自由基和H2O2均有较好的清除作用。巨尾桉叶、皮、芯单宁提取物对DPPH·自由基的最大清除率分别相当于VC的91.08%、93.20%、79.40%；对·OH自由基最大清除率分别相当于VC的181%、125%、132%；对H2O2的最大清除率分别相当于VC的83.60%、65.46%、78.46%。

3.3巨尾桉3部位提取样液清除·OH自由基的效果优于VC。

［1］田玉红.广西桉叶挥发性成分分析及抗菌抗氧化性能研究［D］.南宁：广西大学，2006.

［2］田玉红，刘雄民，陶明有.巨尾桉叶挥发性成分的提取及成分分析［J］.广西科学院学报，2006（S1）：466-468.

［3］陈海，田宏，肖苏尧，等.桉叶抗氧化物的提取与抗氧化性研究［J］.湖南林业科技，2009，36（2）：25-29.

［4］黄增，刘雄民，黄丽葵，等.巨尾桉叶中皂苷的提取分离及其抗氧化活性研究［J］.天然产物研究与开发，2012，24：1113-1121.

［5］黄增，刘雄民，库咏峰，等.巨尾桉单宁的提取分离及其抗菌抗氧化性能［J］.精细化工，2012，29（6）：564-583.

［6］郑燕菲，刘雄民，郭占京，等.巨尾桉叶总黄酮提取条件及其抗氧化抑菌研究［J］.食品工业科技，2014，13：120-123，128.

［7］Hou A J，Liu Y Z，Yang H，et al.Hydrolyzable tannins and related polyohenols from Eucalyptus globules［J］.Journal of Asian Natural Products Research，2000，2（3）：205-212.

［8］陈婷，林红英，张继东，等.G9桉叶抗菌有效部位及活性成分分析［J］.中兽医医药杂志，2010，15（2）：5-7.

［9］湛年勇，姚创程，陆文海，等.按树皮单宁分析［J］.生物质化学工程，2009，43（5）：39-41.

［10］王书园，俞凌云，朱云.单宁的分析研究现状［J］.江苏调味副食品，2008，25（5）：16.

［11］张文华，候旭.单宁抗氧化活性与结构关系的理论研究［M］.皮革科学与工程，2009，19（5）：9-12.

［12］韩丙军，彭黎旭.植物多酚提取技术及其开发应用现状［J］.华南热带农业大学学报，2005，11（1）：21-26.

［13］赵峥嵘.银杏叶中单宁提取工艺的优化研究［J］.河南农业，2009（7）：57-58.

［14］马自超，劳伦斯·波特.桉树叶单宁组分的研究［J］.植物学报，1988，30（5）：534-538.

［15］Haslam E，Haworth R D，Gramshaw J W，et al.The structure of penta and tetragalloylglucoses and some observations on the molecular weight of gallotannins［J］.Chem Soc，1962：2944-2947.

［16］单书香，王本成，李德辉.水解类单宁组份及其结构的研究—Ⅱ橡椀单宁中鞣花酸的分离与鉴定［J］.四川林业科技，1980（3）：28-34.

Extraction，antioxidant activity of tannins from different parts of Eucalyptus Grandis x E.Urophylla

ZHOU Zhou，LONG Feng-xiang，DENG Li-juan，WEI Ting-xin，ZHENG Yan-fei，LIU Xiong-min*
（College of Chemistry and Chemical Engineering of Guangxi University，Nanning 530004，China）

Conventional refluxing extraction and ultrasound assisted extraction were adopted to extract tannins from leaf，bark and core of Eucalyptus Grandis x E.Urophylla.Moreover the antioxidant activity of tannins extracts also was studied.The yields of tannins from leaf，bark and core by conventional refluxing extraction were 4.19%，1.86%and 0.25%respectively，but that were 3.20%，2.25%and 0.19%respectively by ultrasound assisted extraction.The tannins extracts of Eucalyptus Grandis x E.Urophylla different parts had a strong scavenging activity to DPPH·，·OH free radical and H2O2.The scavenging activity of tannins extracts from leaf，bark and core on DPPH·were the equivalent to VCof 91.08%，93.20%and 79.40%，respectively.And the scavenging activity of 3 tannins extracts on·OH reached 181%，125%and 132%of VC，on H2O2equal to 83.60%，65.46%and 78.46%VC.

Eucalyptus Grandis x E.Urophylla；tannins；extract；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2015）16-0129-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.018

2014－12－01

周洲（1993-），男，本科，研究方向：天然产物化工，E-mail：zhouyazj@163.com。

刘雄民（1960-），男，博士，教授，研究方向：天然产物化工，E-mail：xmliu1@gxu.edu.cn。

广西大学“大学生创新创业训练计划”资助项目；国家自然科学基金（11462001）。