四川茶树品种资源中EGCG3″Me研究

李建华，齐桂年，陈盛相，朱明珠

（1.四川农业大学园艺学院，四川雅安625014；2.四川省茶叶产品质量检验中心，四川名山625100）

四川茶树品种资源中EGCG3″Me研究

李建华1，2，齐桂年1，*，陈盛相1，朱明珠1

（1.四川农业大学园艺学院，四川雅安625014；2.四川省茶叶产品质量检验中心，四川名山625100）

采用高效液相色谱法（HPLC）对四川70份茶树品种资源新梢中（-）-表没食子儿茶素-3-O（3-O-甲基）没食子酸酯（EGCG3″Me）含量进行分析，发现3份茶树品种资源富含EGCG3″Me（含量＞10 mg/g），即蜀茶5号、金观音、城西11号。对蜀茶5号新梢季节及叶位变化规律研究，发现春、夏、秋三季，随着新梢叶片成熟，EGCG3″Me含量均先增加后降低；同等叶位相比，EGCG3″Me含量均呈递增趋势；含量最高的叶位为秋梢第二叶，秋梢第一叶至第四叶均超过10 mg/g。以蜀茶5号秋梢加工成4种茶类，发现绿茶、黄茶中EGCG3″Me含量最高，与鲜叶相当，其次为青茶，而红茶中未检出，且萎凋显著增加其含量。建议四川富含EGCG3″Me茶叶将秋梢一芽二、三叶加工成绿茶或黄茶，且在加工前进行适度摊放（轻度萎凋）。

EGCG3″Me，茶树品种资源，季节，叶位，加工

（-）-表没食子儿茶素-3-O-甲基-没食子酸酯（EGCG3″Me）是一种天然存在于茶叶中的O-甲基化儿茶素，并被证明比EGCG具有更强的抗过敏作用［1-2］。国内研究主要集中在茶叶中EGCG3″Me的分离、纯化及检测分析［3-4］，但对富含EGCG3″Me茶树品种资源筛选的报道很少。而关于茶树品种资源新梢中EGCG3″Me含量与生长季节关系的研究仅局限于夏季或春夏［5-7］，未对其含量在不同叶位的变化规律进行研究；同时，茶树品种资源新梢中EGCG3″Me保留量与其加工工艺关系虽已在绿茶、普洱茶、白茶、乌龙茶、红茶有少量报道［7-9］，但在黄茶加工上未有人研究。四川为我国古老茶区之一，不仅拥有丰富的茶树品种资源，而且主产多种茶类［10-12］。但未见关于四川高EGCG3″Me茶树品种资源的筛选研究。

基于上述客观事实，本研究首先采用HPLC法对四川70份茶树品种资源秋梢中EGCG3″Me含量进行测定，筛选出富含EGCG3″Me（＞10 mg/g）的茶树品种资源，系统研究不同季节、不同叶位中EGCG3″Me含量的变化规律，从而确定富含EGCG3″Me茶叶的采摘标准；在此基础上分别制成绿茶、黄茶、乌龙茶和红茶，研究EGCG3″Me在加工过程中的变化规律，以期为富含EGCG3″Me茶树品种资源的筛选、高EGCG3″Me茶叶的制备，以及进一步在食品和制药领域开发和利用天然的EGCG3″Me奠定研究基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

70份茶树品种资源分别种植于四川省名山良种场茶树品种园、四川农业大学茶树品种园和四川夹江天福茶树品种园；没食子酸、咖啡碱、C、EC、EGC、EGCG、ECG标液Sigma公司；EGCG3″Me标液由湖南农业大学茶学教育部重点实验室提供。

3000高压高效液相色谱仪，包括DGP-3600SD泵，WPS-3000自动进样器，TCC-3000柱温箱和DAD-3000检测器，AcclaimTM120（5 μm，120 Å，4.6 mm×250 mm）C18色谱柱，通过Chromeleon®7色谱工作站控制并进行数据处理美国Dionex UltiMate；FDU-2200冷冻干燥机日本东京理化公司；Velocity 18R离心机日本岛津；Arium Comfort纯水机德国赛多利斯股份公司。

1.2实验方法

1.2.1样品制备70份茶树品种资源一芽二叶秋梢，采摘后液氮保存带回实验室，蒸汽杀青，90℃烘干，-20℃冰箱保存备用。

不同季节（春、夏、秋）新梢，采摘后收集其不同叶位（芽、第一叶、第二叶、第三叶、第四叶、第五叶、茎），液氮保存带回实验室，蒸汽杀青，90℃烘干，-20℃冰箱保存备用。

富含EGCG3″Me茶树品种资源的秋梢一芽二、三叶按照相应加工工艺制成绿茶、黄茶、青茶和红茶［13］。绿茶加工主要工序为杀青、揉捻、干燥；黄茶加工主要工序为杀青、揉捻、闷黄、干燥；青茶加工主要工序为萎凋、做青、杀青、揉捻、干燥；红茶加工主要工序为萎凋、揉捻、发酵、干燥。取各工序样，液氮保存，-80℃冷冻干燥，-20℃冰箱保存备用。

1.2.2样品提取准确称取1.2.1干燥的样品粉末150 mg，加入50%乙腈（V/V）25 mL、30℃、120 r/min黑暗下浸提40 min，之后8000 r/min 4℃离心15 min，上清液经适当稀释后，0.45 μm微孔滤膜过滤，备用［14］。

1.2.3儿茶素分析方法采用HPCL方法对EGCG3″Me等儿茶素进行分析。色谱条件如下：

流动相为KH2PO4缓冲液（0.02 mol/L，pH2.5）-乙腈溶液；流速1.0 mL/min；检测波长278 nm；进样量10 μL；柱温25℃［14］。

梯度洗脱程序：8%的B相起始，0～5 min保持8%的B相不变，5～25 min B相从8%线性增加到11%，25～ 50 min B相从11%线性增加到21%，50～51 min B相增加至95%，51～54 min保持B相95%不变，54～55 min B相从95%降至8%，56～60 min保持B相8%。

1.3数据分析

所有测定结果均以平均值±SD（n=3）表示，作图采用Origin 7.0，方差分析采用ANOVA。

2　结果与分析

2.1四川茶树品种资源EGCG3″Me含量测定

四川茶树品种资源EGCG3″Me含量见表1及部分色谱图见图1。从表1可知，不同茶树品种资源EGCG3″Me含量差异大，范围在0～11.04 mg/g之间，但其含量远低于茶叶中主要的四种儿茶素EC、EGC、EGCG、ECG，C含量较低。30份茶树品种资源中含有EGCG3″Me，占总调查资源数的42.86%，其中仅有3份茶树品种资源（蜀茶5号、金观音、城西11号）中EGCG3″Me含量超过10 mg/g；此外，在8～10 mg/g之间的茶树品种资源也仅有3份，为肉桂、川农2号、蒙山11号；含量在6～8 mg/g的茶树品种资源有1份，为铁观音；5份含量在4～6 mg/g左右的茶树品种资源，分别为浙农117、蒙山29号、锡茶5号、黄叶早、霞浦元宵茶；18份含量在0～4 mg/g的茶树品种资源，分别为英红1号、越南大叶、英红2号、安溪水仙、四季春、金萱、翠玉、梅占、黄叶水仙、黄金桂、八仙茶、福建水仙、福选9号、福选4号、龙井长叶、青峰、连南大叶茶、蜀永906。

图1　茶树品种资源蜀茶5号HPLC色谱图Fig.1　Elution profiles of tea lines Shucha5

2.2茶树新梢EGCG3″Me含量季节及叶位变化规律

为了进一步弄清茶树新梢EGCG3″Me含量季节及叶位变化规律，采摘茶树品种资源蜀茶5号的春、夏、秋三季的新梢一芽五叶进行研究。第二叶位色谱图见图2，EGCG3″Me季节及叶位变化规律见图3。从图3可以看出，在春、夏、秋三季中，随着茶树新梢叶片的成熟，从芽、第一叶、第二叶、第三叶、第四叶、第五叶到茎，EGCG3″Me含量均呈现出先增加后降低的趋势。其中，春、夏、秋三季中，含量最高的叶位分别为春梢第四叶、夏梢第二叶、秋梢第二叶，含量分别为7.93、10.92、14.58 mg/g，它们均显著高于同季节茶树新梢的其他叶位（p＜0.05）；而含量最低的叶位均为春梢、夏梢、秋梢的茎，含量分别为0.32、1.05、1.06 mg/g，均显著低于同季节茶树新梢的其他叶位（p＜0.01）。

续表

图2　茶树品种资源蜀茶5号秋梢第2叶HPLC色谱图Fig.2　Elution profiles of tea lines Shucha 5 at the second leaf in autumn

图3　蜀茶5号新梢EGCG3"Me含量季节及叶位变化图Fig.3　Relationship of leaf order，seasons and contents of EGCG3"Me of tea shoots in Shucha 5

同等叶位相比，EGCG3″Me含量均呈递增趋势，如秋梢第二叶中EGCG3″Me含量（14.58 mg/g）是夏梢第二叶含量（10.92 mg/g）的1.34倍，是春梢含量（6.72 mg/g）的2.17倍。富含EGCG3″Me（含量＞10 mg/g）的叶位分别是夏季第二叶、秋季第一叶至第四叶，含量最高的新梢叶位分别为秋季第二叶和第三叶，含量分别为14.58、12.02 mg/g；其次是夏季第二叶、秋季第四叶、秋季第一叶，含量为10.92、10.39、10.02 mg/g。统计分析表明，它们均显著高于同季节茶树新梢的其他叶位（p＜0.05）。因此，为了获得富含EGCG3″Me（含量＞10 mg/g）茶叶，蜀茶5号采摘季节和采摘标准以秋梢一芽二、三叶为佳。

2.3茶叶加工过程中EGCG3″Me含量变化规律

为进一步弄清茶叶加工过程中EGCG3″Me含量变化规律，采摘蜀茶5号的秋梢一芽二、三叶作为鲜叶，分别制成的绿茶、黄茶、青茶、红茶，各茶类加工主要工序中EGCG3″Me含量变化见图4。可以看出，在各茶类干燥工序后，EGCG3″Me含量在绿茶中含量最高，为10.37 mg/g，其次是黄茶、青茶，分别为10.17、9.34 mg/g，红茶中未检测到。其中，鲜叶（10.47 mg/g）加工成绿茶、黄茶后，EGCG3″Me含量变化差异不显著（p＞0.05）。

在绿茶加工过程中，杀青显著降低了鲜叶中EGCG3″Me含量（p＜0.01），但揉捻显著增加了杀青叶中EGCG3″Me含量（p＜0.01），干燥使杀青叶中EGCG3″Me含量显著降低（p＜0.01）。但总体来说，加工而成的绿茶与鲜叶EGCG3″Me含量差异不显著。在黄茶加工过程中，杀青同样显著降低了EGCG3″Me含量（p＜0.01），揉捻显著增加杀青叶EGCG3″Me含量（p＜0.01），但闷黄和揉捻叶中EGCG3″Me含量差异不显著，干燥使闷黄叶EGCG3″Me含量显著降低（p＜0.05），黄茶与绿茶加工过程中EGCG3″Me含量变化规律大体一致，含量同样与鲜叶相当。

在青茶加工过程中，萎凋工序显著增加了鲜叶中EGCG3″Me含量（p＜0.01），之后的做青、杀青中含量差异不显著，但均显著降低了萎凋叶中EGCG3″Me含量（p＜0.01），揉捻使杀青叶中的EGCG3″Me含量显著增加（p＜0.05），但之后的干燥工序使揉捻叶显著降低（p＜0.05）。总体来说，青茶显著降低了鲜叶中EGCG3″Me含量（p＜0.05）。在红茶加工过程中，萎凋同样显著增加了鲜叶中EGCG3″Me含量（p＜0.01），但之后的揉捻、发酵和干燥使其急剧降低，尤其是发酵和干燥工序后，其含量均未检测到。

图4　茶叶加工过程中EGCG3"Me含量变化图Fig.4　Changes in contents of EGCG3"Me during tea processing

3　讨论

Sajio于1982年从茶树品种“Benihomare”鲜叶中分离出EGCG3″Me［15］。之后Chiu和Lin也发现“Chinshin”中也含有EGCG3″Me［9］。本研究也从四川70份茶树品种资源发现含有EGCG3″Me，并且筛选出富含EGCG3″Me的资源，发现其EGCG3″Me的春梢、夏梢和秋梢中含量最高的叶位分别为第四叶、第二叶和第二叶，与之前研究认为的春梢第三叶［16］或第五叶［7］、夏梢第三叶［6-7］含量最高存在一定的差异。汪毅［5］发现在新梢茎中没有检测到EGCG3″Me，而本次研究发现，在春、夏、秋三季中均发现茎中含有少量EGCG3″Me，且秋季＞夏季＞春季。存在差异的原因可能与所研究的富含EGCG3″Me的茶树品种资源自身遗传基因不同有关。

本研究还发现绿茶中EGCG3″Me含量高于黄茶，黄茶高于青茶，红茶中未检测到。原因是绿茶是新梢通过高温杀青使酶失活后干燥加工而成，绿茶的化学成分与新梢类似，更能有效保持鲜叶中EGCG3″Me含量；而黄茶闷黄工序中，儿茶素类物质（EGCG3″Me）发生了轻度的氧化，青茶作为半发酵茶，儿茶素类物质（EGCG3″Me）发生了中度的氧化，红茶则在发酵过程中，儿茶素类物质（EGCG3″Me）在酶作用下发生较为彻底的氧化聚合［11］。因此EGCG3″Me含量，不发酵茶绿茶＞轻度发酵茶黄茶＞中度发酵茶青茶＞全发酵茶红茶。研究还发现萎凋可以显著增加鲜叶中的EGCG3″Me含量，原因可能是萎凋过程中，EGCG3″Me合成酶活性增加，部分EGCG3″Me由EGCG形成［17］，且茶树体内的生物合成途径包括EGCG甲基化形成EGCG3″Me也被证实［18］；绿茶、黄茶、青茶揉捻工序可显著增加EGCG3″Me含量，是由于加工过程中茶叶细胞膜损伤，细胞内的甲基化EGCG被提取出来［9］，而红茶揉捻工序EGCG3″Me含量显著下降，是由于红茶发酵从揉捻开始，其发酵破坏的EGCG3″Me量大于揉捻增加量造成的。

4　结论

采用HPLC法对70份四川茶树品种资源新梢中EGCG3″Me含量进行定量分析，发现了富含EGCG3″Me（＞10 mg/g）品种资源三份，包括：蜀茶5号、金观音、城西11号；春、夏、秋季一芽五叶新梢中EGCG3″Me含量最高为秋梢第二叶。同时还发现，EGCG3″Me含量在萎凋过程中显著增加，但在发酵过程中显著降低，与其他加工方式相比，绿茶、黄茶工艺更能保持鲜叶中EGCG3″Me含量。因此一种生产富含EGCG3″Me茶叶可采摘秋梢一芽二、三叶，并按照绿茶或黄茶工艺加工，且在加工前进行适度摊放（轻度萎凋）。

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Analysis of 3″-Methyl-epigallocatechin gallate in Sichuan tea varieties resources

LI Jian-hua1，2，QI Gui-nian1，*，CHEN Sheng-xiang1，ZHU Ming-zhu1
（1.College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.The Quality Examination Center of Sichuan Tea，Mingshan 625100，China）

3″-Methyl-epigallocatechin gallate（EGCG3″Me）in the young tea leaves of 70 major tea varieties resources in Sichuan were analyzed using HPLC.The results revealed that Shucha 5，Jinguanyin，Chengxi 11 were found to contain higher levels of EGCG3″Me（＞10 mg/g）.The EGCG3″Me levels of different positions of tea line Shucha 5‘five and a bud’shoots from spring to autumn were also analyzed.The results showed that the contents of EGCG3″Me presented first an increasing and then a decreasing trend with the leaf maturity. Compared with the same leaf order，EGCG3″Me contents were increasing.The second leaf in autumn were the highest，the first to the fourth leaves were more than 10 mg/g.The fresh tea leaves in autumn of Shucha 5 were processed to four different types of teas，The EGCG3″Me levels of green tea and yellow tea were the highest，similar to fresh tea leaves，followed by oolong tea.However，black tea do not contain detectable EGCG3″Me. The content of EGCG3″Me increased distinctly during withering.Based on these results，a better way to produce tea leaves rich in EGCG3″Me was proposed，which includes picking fresh tea leaves with two or three leaves and a bud in autumn，processed to green tea or yellow tea，modest spreading（mild withering）before processing.

3″-methyl-epigallocatechin gallate；tea varieties resources；seasons；leaf order；processing

TS201.1

A

1002-0306（2015）16-0108-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.014

2014－11－18

李建华（1984-），女，博士，研究方向：茶叶加工理论与技术，E-mail：csx810905@163.com。

齐桂年（1956-），男，博士，教授，研究方向：茶树育种与精深加工，E-mail：guinian5612@163.com。

四川省科技成果转化重点项目（12CGZHZX0579）；四川省科技支撑计划项目（14ZC1700）；名山茶树资源评价（063h1300）。