尖锐湿疣患者皮损中朗格汉斯细胞和浆细胞样树突细胞的检测

朱小霞 周强 程浩 朱红明

·研究报道·

尖锐湿疣患者皮损中朗格汉斯细胞和浆细胞样树突细胞的检测

朱小霞 周强 程浩 朱红明

目的 探讨朗格汉斯细胞（LC）和浆细胞样树突细胞（pDC）在尖锐湿疣（CA）感染发病机制中的可能作用。方法 免疫组化SP法检测23例CA患者皮损中CD1a+LC和CD2AP+pDC、CD123+pDC的表达和分布情况，以其中13例CA组织的边缘正常皮肤为对照，比较CA皮损和边缘正常皮肤中CD1a+LC、CD2AP+pDC、CD123+pDC表达密度和阳性率的差异。结果 CD1a+LC主要位于表皮基底层上棘层，少数在真皮乳头层。CA皮损中CD1a+LC在表皮层和真皮层的密度及阳性率与边缘正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。CD2AP+pDC、CD123+pDC主要位于真皮乳头层，CA患者皮损中CD2AP+pDC、CD123+pDC的密度和阳性率均比边缘正常对照组显著增高（P<0.05）。结论 人乳头瘤病毒感染影响局部黏膜的pDC数量，LC数量未见变化。

尖锐湿疣；郎格尔汉斯细胞；树突细胞；免疫组织化学；人乳头瘤病毒

尖锐湿疣（CA）是由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起的皮肤黏膜疾病，临床上易复发，难治愈。目前认为，HPV感染后，机体局部细胞免疫功能受损是HPV持续感染和尖锐湿疣反复发作的重要原因。朗格汉斯细胞（LC）和浆细胞样树突细胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC）是皮肤组织中两大重要的树突细胞，其中LC是启动免疫应答的关键细胞，而pDC是免疫反应的重要细胞，其通过pDC/TLR通路介导分泌I型干扰素（IFN），发挥抗病毒作用。本研究通过免疫组化方法检测CA皮损中LC的标记分子CD1a和pDC的特异性表面标志分子CD2AP、CD123的表达情况，探讨它们在CA发病机制中的作用。

一、资料与方法

1.临床资料：2012年10月至2013年8月，宁波市第一医院和浙江大学医学院附属邵逸夫医院收集的23例CA初发患者，符合2000年卫生部疾病控制司制订的CA诊断标准，并经组织病理证实为CA患者。其中男18例，女15例，年龄21～42岁，病程1周至2个月。13例对照取自23例CA患者中皮损边缘正常皮肤。所有患者均无明显免疫缺陷病史，无糖尿病和严重肝肾功能损害，无合并使用免疫抑制剂的疾病。

2.试剂：CD1a+鼠抗人单克隆抗体、CD2AP+鼠抗人单克隆抗体和CD123+鼠抗人单克隆抗体均为英国Abcam公司产品；即用型UltrasensitiveTMSP免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒均为北京中杉生物公司产品。

3.方法：

（1）免疫组化染色：取CA患者局部皮损组织，4%甲醛固定后常规制成蜡块和切片。分别以CD1a+鼠抗人单克隆抗体、CD2AP+鼠抗人单克隆抗体和CD123+鼠抗人单克隆抗体为一抗，按免疫组化SP试剂盒说明书进行LC和pDC染色，以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。将染色后的切片置于显微镜下观察并判断结果。

作者单位：315010浙江，宁波市第一医院（朱小霞、朱红明）；浙江大学医学院附属邵逸夫医院（周强、程浩）

图1 CD1a在CA皮损和边缘组织中的表达（SP×400） 1A：CA皮损表皮层较多黄褐色树枝状细胞，棘层为主，胞质染色；1B：CA真皮乳头层少量黄褐色不规则形细胞，胞质染色；1C：CA边缘组织表皮层较多黄褐色树突细胞，胞质染色；真皮乳头层少量黄褐色细胞，胞质染色

（2）结果判断：CD1a染色观察：光镜下细胞膜和（或）细胞质呈黄褐色树枝状突起的细胞为阳性细胞；CD2AP和CD123染色观察：光镜下细胞膜和（或）细胞质呈现棕黄或黄褐色颗粒的细胞为阳性细胞。×400光镜下，每张切片随机选取皮损处表皮为主的5个视野，计数每视野表皮内阳性细胞数和表皮细胞总数；再随机选取真皮乳头层为主的5个视野，计数每视野真皮阳性细胞数和真皮浸润细胞总数。边缘正常皮肤计数方法同皮损处。阳性细胞密度=5个视野阳性细胞总数/5个视野总细胞数；阳性率=含阳性细胞的病例数/总病例数×100%。

4.统计学方法：采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料用±s表示，两组间比较用t检验，计数资料比较采用χ2检验，相关分析采用Pearson相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.CD1a的表达：CA皮损和边缘正常皮肤表皮层和真皮层均可见CD1a+LC细胞，表皮层阳性细胞胞体大，细胞突起多，真皮层阳性细胞胞体相对小，细胞突起少（图1）。CA皮损组织和边缘正常皮肤组织中表皮的CD1a+LC细胞密度分别为0.024±0.013和0.020±0.013，两组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）；CA皮损组织和边缘正常皮肤组织中真皮的CD1a+LC细胞密度分别为0.041±0.051和0.033±0.042，两组间差异无统计学意义（P>0.05）。23例CA皮损组织中CD1a表达阳性率为100%，边缘正常皮损组织CD1a表达阳性率为92.3%（12/13），两组间差异无统计学意义（χ2=0.086，P>0.05）。

2.CD2AP的表达：CD2AP阳性细胞主要见于真皮乳头层，表皮层未见阳性细胞（图2）。CA皮损组织CD2AP+pDC细胞密度0.105±0.091高于边缘正常皮肤组织0.031±0.045，差异有统计学意义（P<0.05）。23例CA皮损组织中有21例呈CD2AP阳性表达，阳性率为91.3%，高于边缘正常皮肤组织CD2AP表达阳性率53.8%（7/13），差异有统计学意义（χ2=4.749，P<0.05）。

3.CD123的表达：CD123阳性细胞主要见于真皮乳头层，表皮层未见阳性细胞（图3）。CA皮损组织CD123+pDC细胞密度0.089±0.063高于边缘正常皮肤组织0.025±0.035，差异有统计学意义（P<0.05）。23例CA皮损组织中有21例呈CD123阳性表达，阳性率为91.3%，高于皮损边缘正常皮肤组织CD123表达的阳性率53.8%（7/13），差异有统计学意义（χ2=4.749，P<0.05）。

4.CD2AP和CD123的相关性：CA皮损中，CD2AP与CD123阳性细胞密度呈显著正相关（r=0.696，P<0.05）。

5.LC和pDC的相关性：CA皮损中LC密度和pDC密度无相关性（r=0.127，P>0.05）。

三、讨论

CA是由HPV感染引起的一种常见的性传播疾病，其反复难治愈的主要原因被认为是机体不能建立对HPV感染有效的免疫应答。LC最具特异性的标记之一是CD1a，人表皮LC是能表达CD1a的唯一细胞［1-2］，通过检测上皮内CD1a的表达，可以了解上皮中LC的数量。有关CA组织中LC变化的研究结论不一，有研究发现，CA皮损中CD1a+LC数量较正常人［3］和慢性炎症中明显减少［4］，也有研究［5］发现，CA 皮损中CD1a+LC数量、密度与正常人无差异。本研究发现，CA皮损内CD1a+LC的形态、表达数量和密度与边缘正常皮肤差异无统计学意义，提示CA皮损中LC数量、密度以及形态变化不是其局部免疫异常的主要原因。

图2 CD2AP和CD123在CA皮损和边缘组织中的表达（SP×400） 2A：CA皮损真皮乳头层CD2AP阳性表达细胞，胞质着棕色；2B：CA边缘组织真皮层未见CD2AP阳性表达细胞；2C：CA皮损真皮乳头层CD123阳性表达细胞，胞质着棕色；2D：CA边缘组织真皮层未见CD123阳性表达细胞

本研究结果发现，CA皮损中，CD123和CD2AP的表达非常一致，故CD123和CD2AP的阳性表达细胞均认为是pDC。此外，CA皮损组织CD123+pDC和CD2AP+pDC的密度和阳性率均明显高于边缘正常皮肤组织，提示CA皮损中pDC数量有所增加，推测HPV感染影响局部黏膜的pDC数量，pDC可能参与了机体局部抗HPV感染的免疫反应。本研究还发现pDC和LC的密度无相关性，提示pDC和LC在CA局部免疫反应中各司其职。HPV感染是否导致LC功能受损和pDC/TLR下游通路阻断，以及pDC与Treg之间的相互作用尚不清楚，有待进一步研究。

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［5］鲁建云,吴志强,黎明,等.尖锐湿疣皮损中朗格汉斯细胞功能状态的研究［J］.中国男科学杂志,2008,22（11）:17-21.

Detection of Langerhans cells and plasmacytoid dendritic cells in condyloma acuminatum lesions of patients

Zhu Xiaoxia*,Zhou Qiang,Cheng Hao,Zhu Hongming.*Ningbo First Hospital,Ningbo 315010,Zhejiang,China

ObjectiveTo investigate the possible roles of Langerhans cells（LCs）and plasmacytoid dendritic cells（pDCs）in the pathogenesis of condyloma acuminatum（CA）.MethodsTissue specimens were obtained from the lesions of 23 patients with CA and from perilesional normal skin of 13 of the 23 patients.The expressions and distribution of CD1a,CD2AP and CD123 were analyzed using the streptavidin-peroxidase （SP）immunohistochemical method.Statistical analysis was carried out to compare the density and percentage of CD1a+LCs,CD2AP+pDCs and CD123+pDCs between lesional skin and perilesional normal skin.ResultsMost CD1a+LCs were observed in the prickle cell layer of the epidermis,and a few in the papillary layer of the dermis.There was no significant difference in the density or percentage of CD1a+LCs in the epidermis or dermis between the lesional and perilesional skin specimens（allP>0.05）.CD2AP+pDCs and CD123+pDCs were distributed mainly in the papillary layer of the dermis,and their density and percentage were significantly higher in the lesional than in the perilesional skin specimens （allP<0.05）.ConclusionHuman papillomavirus infection may affect the quantity of pDCs but not LCs in local mucous membranes.

Condylomata acuminata;Langerhans cells;Dendritic cells;Immunohistochemistry;Human papillomavirus

Cheng Hao,Email:hz_chenghao@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.05.011

高等学校博士学科点专项科研基金（20100101110028）；宁波市自然科学基金（2012A610218）；宁波市医学科技计划项目（2011B04）

程浩，Email：hz_chenghao@126.com

2014-07-01）

（本文编辑：吴晓初）