梅毒螺旋体Tp0844重组蛋白的表达、纯化及免疫反应性研究

刘双全 刘琼

梅毒螺旋体Tp0844重组蛋白的表达、纯化及免疫反应性研究

刘双全 刘琼

目的 克隆、表达梅毒螺旋体重组蛋白Tp0844，纯化表达产物并进行免疫反应性分析，筛选与宿主具有高反应性的Tp主要蛋白。方法 通过生物信息学分析，获取Tp0844基因序列，构建原核载体进行诱导表达；Ni-NTA亲合层析柱纯化重组蛋白，Western印迹法检测其重组蛋白与梅毒阴阳性血清的反应情况。结果 成功构建PET-30a（+）-Tp0844原核表达重组体，经诱导表达后发现该重组体可高表达出可溶性的重组蛋白，经亲和层析纯化后获得了相对分子质量为43 000的重组蛋白；以梅毒IgG抗体阴、阳性血清为一抗，采用Western印迹法检测发现，Tp0844重组蛋白与梅毒阳性血清能发生明显特异反应，而与健康阴性血清未出现反应条带。结论 可溶性重组表达的Tp0844蛋白具有较好的免疫反应性，可作为梅毒发病机制研究的候选抗原。

苍白密螺旋体；重组蛋白质类；TP0844；免疫学；免疫反应性

梅毒是由梅毒螺旋体（Treponema Pallidun，Tp）感染引起的危害人类健康的性传播疾病［1］。其不仅可严重损害人体的多个器官，还可由母体经胎盘垂直传播给胎儿，引起早产、流产、死胎和畸胎或胎传梅毒，严重影响出生人口质量［2］。如何有效控制和预防梅毒，已成为普遍关注的公共卫生问题，而进行梅毒早期诊断方法研究以及阐明Tp的发病机制是控制本病的关键环节。由于Tp不能体外连续人工培养，对于其发病机制研究进展缓慢。近年来，基因序列分析发现，Tp缺乏明显的毒力因子编码基因，包括革兰阴性细菌常见的内毒素（脂多糖）、Ⅲ型分泌系统、热休克蛋白等细胞毒因子的编码基因［2-5］。因而，筛选与宿主具有高反应性的Tp主要蛋白或膜蛋白等致病因素是进行Tp发病机制研究的关键。本研究经筛选、克隆表达、鉴定Tp0844重组蛋白并进行免疫反应性的研究，现报告如下。

资料与方法

一、主要试剂和材料

1.菌株与载体：Tp Nichols标准株、PET-30a（+）质粒、表达宿主菌E.coliBL-21均为本室保存。

2.主要试剂：蛋白相对分子质量标准，限制性内切酶、T4连接酶、DNA相对分子质量标准、PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒，辣根过氧化酶标羊抗人IgG，Taq PCR mix，Ni-NTA亲和层析柱均购于德国Qiagen公司，梅毒阳性血清标本为经梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）确证梅毒患者血清；梅毒阴性标本为健康体检中心健康对照血清，用酶联免疫吸附试验（ELISA）和Trust初筛阴性标本。

作者单位：421001湖南衡阳，南华大学附属第一医院检验科

3.主要仪器：德国Biometra公司生产梯度PCR仪；美国Beckman公司生产DU640核酸蛋白定量分析仪。

二、方法

1.Tp基因组DNA的提取：取Tp Nichol株感染新西兰兔睾丸组织析出物于灭菌试管中，于水浴摇床150×g振荡3 h，灭菌纱布过滤，取滤出物制备Tp DNA模板，操作按照Qiagen全基因组提取试剂盒说明进行。

2.Tp0844基因的扩增：从基因库中查询Tp0844基因序列，软件分析选去除信号肽序列，设计1对PCR扩增引物：P1（BamHⅠ酶切位点）：5′-GGATCCATGAGAGTTGCAATCAAT-3′，P2（EcoRⅠ酶切位点）5′-GAATTCCTACCGCTTCTGCGAGAT-3′，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以Tp Nichols株的基因组DNA为模板，PCR扩增Tp0884基因，94℃预变性 3 min；94℃变性 30 s，46℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环；循环结束后再72℃终延伸5 min。取PCR产物经1%琼脂糖电泳，在紫外灯下观察结果。

3.Tp0844重组表达质粒的构建和鉴定：通过BamH和EcoRI酶切位点将Tp0844基因克隆进pET-30a（+）质粒中构建重组质粒pET-30a（+）/Tp0844，筛选阳性质粒，作酶切鉴定和PCR鉴定，初步鉴定的阳性质粒送上海市英潍捷基公司测序。经测序鉴定的重组质粒转化至表达宿主菌E.coliBL21中构建重组表达体。

4.Tp0844基因的诱导表达：挑选单个阳性菌落37℃培养过夜，次日取培养物1∶50接种继续培养至菌体A600=0.6时，加入IPTG（终浓度1.0 mmol/L）37℃诱导培养4 h，同时设未诱导组及阴性对照组。离心收集菌体，用超声波破碎菌体后离心收集沉淀与上清，SDS-PAGE电泳分析表达结果。

5.Tp0844重组蛋白的纯化：大量诱导表达重组菌，收集菌体，用缓冲液PBS浮菌并加入适量的溶菌酶作用，超声波破碎菌体，离心收集上清上Qiagen Ni-NTA亲和层析柱纯化，具体操作见说明书。纯化产物作SDS-PAGE分析。

6.Western印迹分析重组蛋白的免疫反应性：以1∶100稀释的经TPPA法确证的梅毒阳性或健康血清（阴性对照）为一抗，二抗为辣根过氧化酶标山羊抗人IgG（1∶10 000稀释），利用增强化学发光法（enhanced chemiluminescent detection，ECL）显色，暗室曝光显影，检测特异性条带。

结 果

1.Tp0844基因的克隆与鉴定：PCR产物经1%琼脂糖电泳，在约1 000 bp位置可见一明显特异性条带，片段大小与预期一致（图1）。切胶回收PCR产物，并连接 PET-30a（+）载体，酶切鉴定（图 2），可见两株克隆菌均正确，经测序鉴定证明插入片段为Tp0844目的基因，序列测定结果与基因库上发表的序列完全一致。

2.重组蛋白的诱导、表达与纯化：将重组质粒转化至E.coliBL21表达宿主菌，挑选阳性重组菌进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析发现在相对分子质量为43 000处有一明显蛋白条带，与预期的相对分子质量大小相符（图3，4），IPTG浓度在1 mmol/L诱导时间为6 h时蛋白表达量最大，并且发现表达蛋白主要存在于上清中。

图1 Tp0844基因PCR扩增结果 M：标准参照物；1：PCR扩增产物；2：阴性对照

图2 重组质粒pET-30a（+）/Tp0844双酶切电泳M：标准参照物；1：pET30a（+）空质粒；2：Tp0844重组质粒1双酶切；3：Tp0844重组质粒；4：Tp0844重组质粒2双酶切；5：Tp0844重组质粒2

图3 37℃重组质粒在大肠杆菌中1 mmol/L IPTG诱导不同时间表达的SDS-PAGE结果 M:标准参照物；1：rTp0844诱导6 h上清；2：rTp0844诱导4 h上清；3：rTp0844诱导2 h上清；4：rTp0844诱导6 h沉淀；5：rTp0844诱导2 h沉淀；6：rTp0844诱导4 h沉淀；7：rTp0844未诱导

图4 重组TP0844蛋白纯化结果 M：标准参照物；2：裂解上清；3～8：洗涤液过柱流出物；9：蛋白洗脱液（目的蛋白）

图5 TP0844重组蛋白的Western印迹检测 1：Tp阳性血清；2：健康阴性血清

3.重组Tp0844蛋白的免疫反应性检测：以梅毒IgG抗体阴、阳性血清为一抗，采用Western印迹方法检测Tp0844重组蛋白的免疫反应性。结果显示，诱导产物与Tp阳性血清在预计位置出现明显特异反应条带，而与阴性血清未出现反应条带（图 5）。

讨 论

近年来，全世界每年新增约1 500万新感染病例［1-2，6-11］，近 3 年全球梅毒的发病率年均增长率达20%，我国的梅毒感染率和发病率也呈上升趋势，成为一个备受关注的公共卫生问题［1-2，6-11］。寻找 Tp的致病因素、阐明Tp发病机制是控制梅毒的关键环节。由于Tp不能体外连续人工培养，缺乏遗传操作系统及外膜的易脆性导致对其不能进行遗传操作，严重阻碍了从分子水平对Tp发病机制的研究。Tp全基因序列的解析极大地促进了对Tp基因结构与功能的研究［2］。随着基因工程技术的迅速发展，使得梅毒Tp重组蛋白的获得相对容易,一方面为建立现有梅毒血清学诊断的替代方法提供了条件，同时为梅毒免疫功能及发病机制研究开辟了一条新的途径。

作为有望在梅毒致病过程中发挥重要作用的蛋白一般需要满足两个条件：首先，必须能早期接触机体，在感染早期即能在血液里检测到其相应的抗体；其次要求蛋白含量较高、免疫原性强［3-5，11］。进行Tp发表机制的研究首先须从筛选蛋白入手。Tp0844基因全长1 050 bp，编码350个氨基酸、相对分子质量约为43 000，在Tp的细胞定位尚不清楚，其生物学功能也尚未明了，且整个分子的抗原性较强，存在多个强抗原表位，可以作为梅毒发表机制研究的候选抗原。本研究的目的是通过克隆、表达获得重组Tp0844蛋白进行免疫反应性的研究。本文结果显示，成功获得高纯度、可溶性表达的重组蛋白Tp0844重组蛋白；进一步检测纯化的重组蛋白的免疫反应性，经Western印迹分析，其能与梅毒感染阳性血清发生反应，而与梅毒阴性血清未发生反应，证明Tp0844重组蛋白具有良好的免疫反应性，从而为下一步研究其在梅毒发病中的作用，如黏附、穿透、播散及诱导宿主炎症反应作用，完整解析Tp0844的生物学功能及进行梅毒早期诊断方法学研究奠定了基础。

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Expression,purification and evaluation of immunoreactivity of the recombinant protein Tp0844 ofTreponema pallidum

Liu Shuangquan,Liu Qiong.Department of Clinical Laboratory,First Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang 421001,Hunan,China

Treponema pallidum;Recombinant proteins;TP0844;Immunology;Immunoreactivity

Liu Shuangquan,Email:dantelliu@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.05.007

国家自然科学基金（81201331）；湖南省自然科学基金（11JJ4076）；湖南省教育厅青年基金（11B107）

刘双全，Email：dantelliu@163.com

2014-05-13）

（本文编辑：吴晓初）

【Absrtact】ObjectiveTo clone,express,purify and evaluate the immunoreactivity of the recombinant protein Tp0844 ofTreponema pallidum（Tp）,and to screen major Tp proteins with high host reactivity.MethodsThe Tp0844 gene sequence was obtained through bioinformatics analysis.A prokaryotic expression vector of the Tp0844 gene was constructed and transformed intoE.coliBL21 followed by isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside （IPTG）induction for the expression of the recombinant protein Tp0844.Nickel-NTA affinity chromatography columns were utilized to purify the recombinant protein,and Western blotting was performed to evaluate the reactivity of the recombinant protein with sera positive or negative for anti-Tp IgG antibodies.ResultsThe recombinant prokaryotic expression vector PET-30a（+）-Tp0844 was successfully constructed.After IPTG induction,a soluble recombinant protein with a relative molecular mass of about 43 000 was highly expressed,and purified by affinity chromatography.Western blotting showed that the Tp0844 recombinant protein specifically reacted with anti-Tp IgG antibody-positive sera,but not with anti-Tp IgG antibody-negative sera.Conclusions The soluble recombinant protein Tp0844 has good immunoreactivity,and can serve as a candidate antigen for investigation into the pathogenesis of syphilis.