β联蛋白对过氧化氢诱导人皮肤成纤维细胞增殖活性及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响

田黎明 谢红付 李吉 杨婷 彭圆 胡威

·论著·

β联蛋白对过氧化氢诱导人皮肤成纤维细胞增殖活性及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响

田黎明 谢红付 李吉 杨婷 彭圆 胡威

目的 观察高表达的β联蛋白对过氧化氢（H2O2）诱导衰老人皮肤成纤维细胞（HSF）增殖活性以及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响。方法 实验分3组。HSF细胞分别转染pcDNA3.1-β联蛋白或空载体pcDNA3.1，然后150 μmol/L H2O2处理2 h。噻唑蓝检测细胞增殖活性，流式细胞仪检测细胞凋亡水平，RTPCR和Western印迹分析凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达。结果 HSF+空载体组、HSF+空载体+H2O2组、HSF+β联蛋白+H2O2组细胞增殖活性分别为0.792±0.012、0.462±0.012、0.521±0.015，细胞凋亡率分别为（3.407±0.217）%、（24.555±1.793）%、（15.360±0.755）%，各组比较，差异有统计学意义（均P＜0.01）。HSF+空载体+H2O2组Bcl-2 mRNA和蛋白水平（与GAPDH mRNA和蛋白的比值分别为0.333±0.003和0.336±0.004）明显低于HSF+空载体组（分别为0.507±0.013和0.514±0.021），两组比较，均P＜0.01。HSF+β联蛋白+H2O2组Bcl-2 mRNA和蛋白水平分别为0.404±0.006和0.411±0.005明显高于HSF+空载体+H2O2组，两组比较，均P＜0.01。HSF+空载体+H2O2组Bax mRNA和蛋白水平（与GAPDH mRNA和蛋白的比值分别为0.451±0.002和0.460±0.008）明显高于HSF+空载体组，两组比较，均P＜0.01。HSF+β联蛋白+H2O2组Bax mRNA和蛋白水平（分别为0.339±0.012和0.346±0.013）明显低于HSF+空载体+H2O2组，两组比较，均P＜0.01。结论 高表达的β联蛋白能够提高衰老人皮肤成纤维细胞增殖活性。

成纤维细胞；细胞衰老；β联蛋白；细胞凋亡；基因，Bcl-2；基因，Bax

β联蛋白（β-catenin）是经典的Wnt信号通路的下游效应器。研究发现，β联蛋白在调控细胞增殖、分化、凋亡和衰老方面有着重要的作用［1-3］。本课题前期［4］实验发现，β 联蛋白在过氧化氢（H2O2）所致的人皮肤成纤维细胞（HSF）衰老中的表达明显下调；β联蛋白能够抑制细胞衰老相关β-半乳糖甘酶（SA-β-gal）和细胞活性氧（ROS）的表达，同时上调SOD的活性［5］，推测β联蛋白可能具有抗细胞衰老的作用。我们进一步研究高表达的β联蛋白对H2O2所致衰老的HSF增殖活性以及凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关 x蛋白（Bax）表达的影响，探讨β联蛋白对衰老成纤维细胞增殖活性和凋亡相关基因的调节作用。

资料与方法

一、资料

T-Gradient Thermoblock PCR仪产自德国Denver公司，凝胶影像分析系统Jeldoc 2000型产自美国BioRad公司，Synergy H4全功能酶标仪产自美国BioTek公司，流式细胞仪产自德国Miltenyi Biotec GmbH公司，抗Bcl-2单抗、抗bax单抗、抗GAPDH单抗产自美国Santa Cruz生物公司。

二、方法

1.HSF分离与培养［4］：小儿包皮获得HSF，DMEM培养基加10%胎牛血清（FBS）培养，细胞长至80%融合后0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）1∶1消化传代扩增，取2～4代HSF用于试验。

2.细胞转染：实验方法参考文献［5］。

3.H2O2处理HSF诱导衰老模型：实验方法参考文献［5］。

4.实验分组：转空载体组（HSF+空载体）、转空载体H2O2处理组（HSF+空载体+H2O2）以及转β联蛋白H2O2处理组（HSF+β联蛋白+H2O2）。

5.噻唑蓝（MTT）测定细胞增殖活性：转染前后的HSF细胞融合度达80%时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，1640培养液制成单细胞悬液，接种于96孔板，各实验组在5%CO2，37℃条件下培养，当细胞融合达70%以上时，进行实验。对照组未经H2O2处理。然后每孔加入MTT 溶液（5 g/L）20 μl，37℃继续培养4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶充分溶解。用Synergy H4全功能酶标仪，波长在570 nm处，测定各孔的吸光度（A值），以示细胞增殖活性情况。以上实验重复3次。

6.细胞凋亡的检测：培养24 h后收集转染前后各组细胞，4℃PBS洗涤细胞2次，弃上清，加结合缓冲液调整细胞密度为1×106/ml，取100 μl细胞悬液到5 ml管中，每管加Annexin V FITC和PI各5 μl混匀，室温避光 5 min，加 400 μl结合缓冲液，0.5 h 内行流式细胞仪检测。以上实验重复3次，取平均值。

7.RT-PCR检测HSF中Bcl-2、Bax mRNA的表达：Trizol抽提细胞总RNA，RT-PCR分别检测Bcl-2 Bax在各实验组HSF中mRNA的表达。根据在线引物设计软件（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）设计的Bcl-2 基因，正向引物：5′-GCCTCTGTTTGATTTCTCC T-3′；反向引物：5′-TCACTTGTGGCCCAGATAGG-3′Bax基因，正向引物：5′-CTGAGCAGATCATGAAGAC A-3′；反向引物：5′-CTCTGCAGCTCCATGTTACT-3′内参磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因，正向引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′；反向引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。PCR反应体系和PCR反应条件参考文献［4］。用凝胶分析系统扫描拍照检测各电泳条带的灰度值（Bcl-2/GAPDH比值、Bax/GAPDH比值），得到Bcl-2、BaxmRNA的相对含量。

8.Western印迹检测HSF中Bcl-2、Bax蛋白的水平：Western印迹方法参照文献 ［4］。在冰上用PIPA溶解细胞，旋转使细胞充分破碎，离心后的上清分装到0.5 ml离心管中，测蛋白浓度或放于-70℃保存。取蛋白样品加入5×变性上样缓冲液，100 V电压跑胶，转PVDF膜，室温振荡封闭1 h。加入一抗（Bcl-2 1 ∶200或 Bax 1∶200；GAPDH 1 ∶3 000）4℃过夜，TTBS洗膜，10 min×3次，加入二抗（HRP 1∶10 000），室温振荡孵育1 h。在PVDF膜上均匀的涂抹化学发光底物，保持2 min。采用凝胶成像分析软件分析，记录每条蛋白电泳带的灰度值。

9.统计分析：所有数据均用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据以±s表示，多组间比较采用One-way ANOVA检验，两组间比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、各组细胞增殖活性的检测结果

HSF+空载体+H2O2组较HSF+空载体组细胞增殖活性明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；HSF+β联蛋白+H2O2组较HSF+空载体+H2O2组细胞增殖活性明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

二、各组细胞凋亡率检测结果

HSF+空载体组细胞凋亡率是（3.407±0.217）%，HSF+空载体 +H2O2组细胞凋亡率是（24.555±1.793）%，HSF+β联蛋白 +H2O2组细胞凋亡率是（15.360±0.755）%。HSF+空载体+H2O2组较HSF+空载体组细胞凋亡率明显上升，差异有统计学意义（P＜0.01）。HSF+β联蛋白+H2O2组较HSF+空载体+H2O2组细胞凋亡率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图1。

三、各组HSF中Bcl-2、Bax的表达

HSF+空载体 +H2O2组较HSF+空载体组Bcl-2的表达水平明显下调，而Bax水平明显上升，差异有统计学意义（P＜0.01）。HSF+β联蛋白+H2O2组较HSF+空载体+H2O2组Bcl-2的表达水平明显上升，而Bax水平明显下调，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

讨 论

研究表明，氧化应激可以导致细胞增殖活性降低，引起细胞凋亡加速，导致细胞衰老。抑制氧化应激反应，可以提高细胞增殖活性，降低细胞凋亡，延缓细胞衰老［6-8］。在本实验及我们既往的研究中发现，H2O2所致的人皮肤成纤维细胞衰老模型中，氧化应激水平（ROS活性）增高，衰老的人皮肤成纤维细胞增殖活性较正常人皮肤成纤维细胞增殖活性明显降低，且细胞凋亡率较前明显上调；转染β联蛋白后，氧化应激反应受到一定的抑制，ROS以及细胞凋亡率明显下调，细胞增殖活性明显提高，且延缓了细胞衰老表型［4-5］。

表1 各实验组人皮肤成纤维细胞活性（±s）

表1 各实验组人皮肤成纤维细胞活性（±s）

注：n=3，v=4。a：HSF+空载体+H2O2组与HSF+空载体组比较，P＜0.01；b：HSF+β 联蛋白 +H2O2组与 HSF+空载体 +H2O2组比较，P＜0.01

组别 细胞活性（A值）HSF+空载体 0.792±0.012 HSF+空载体+H2O2 0.462±0.012a HSF+β联蛋白+H2O2 0.521±0.015b

Bcl-2蛋白家族调控着内源性的线粒体凋亡通路，是抑制细胞凋亡的关键因子，参与细胞衰老［9］。Bcl-2基因的过表达有助于受损细胞的克隆修复，防止细胞程序性死亡，从而维持细胞永生化［10］。Bax是内在凋亡途径中的一个关键的促凋亡分子，其插入到线粒体膜触发释放到细胞质中，从而导致细胞色素 C、caspase 活化和随后的细胞凋亡［11］，Bax 蛋白的过度表达可加速细胞凋亡［12］。国外学者研究发现，β联蛋白通过对Akt通路和Bcl-2家族成员的促凋亡蛋白Bax的影响，来调控神经细胞的凋亡［13］。另一学者通过对胸腺细胞中β联蛋白和Bax的关系研究发现，β联蛋白抗凋亡的部分原因是因为调控了 Bax 的表达［14］。Wang 等［15］研究发现，上调 β 联蛋白可以靶向抑制Bax介导的线粒体膜的损伤，以及减轻生理应激所致的肾上皮细胞凋亡。我们的研究与国内外学者的研究较为一致，结果表明，在人皮肤细胞衰老模型中，抗凋亡基因Bcl-2的表达较对照组明显下调，促凋亡基因Bax的活性较对照组明显增强，可见氧化应激反应介导了细胞衰老和凋亡相关基因的表达。转染β联蛋白后，抗凋亡基因Bcl-2的表达明显上调，促凋亡基因Bax的活性明显被抑制，同时调控了衰老相关表型［5］。推测，β联蛋白可能是通过上调凋亡基因Bcl-2的表达以及抑制促凋亡基因Bax的活性，来影响衰老的人皮肤成纤维细胞凋亡的。然而，β联蛋白调控衰老的人皮肤成纤维细胞凋亡确切的细胞因子，可能的信号通路以及β联蛋白调控人皮肤成纤维细胞凋亡与延缓人皮肤成纤维细胞衰老间的相互关系，尚待进一步研究。

图1 HSF细胞凋亡散点图。HSF+空载体+H2O2组与HSF+空载体组比较，差异有统计学意义，P＜0.01；HSF+β联蛋白+H2O2组与HSF+空载体+H2O2组比较，P＜0.01

表2 HSF转染前后Bcl-2、Bax mRNA和蛋白水平（±s）

表2 HSF转染前后Bcl-2、Bax mRNA和蛋白水平（±s）

注：n=3，v=4。a：HSF+空载体+H2O2组与HSF+空载体组比较，P＜0.01；b：HSF+β联蛋白+H2O2组与HSF+空载体+H2O2组比较，P＜0.01

组别 Bcl-2/GAPDH mRNA Bax/GAPDH mRNA Bcl-2/GAPDH蛋白 Bax/GAPDH蛋白HSF+空载体 0.507±0.013 0.303±0.005 0.514±0.021 0.320±0.013 HSF+空载体+H2O2 0.333±0.003a 0.451±0.002a 0.336±0.004a 0.460±0.008a HSF+β联蛋白+H2O2 0.404±0.006b 0.339±0.012b 0.411±0.005b 0.346±0.013b

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“中国中药杯”全国皮肤镜摄影赛暨病例征集赛征稿通知

为了促进皮肤镜在我国的应用，提高临床诊断水平，促进中国皮肤科事业发展，中华医学会皮肤性病学分会皮肤病数字化诊断亚学组与中国中药有限公司共同举办以“镜善镜美”为主题的“中国中药杯”全国皮肤镜摄影赛暨病例征集赛。

一、征集内容：包含皮肤镜照片（临床皮肤病照片、皮肤镜照片各一张）及配套病例。

二、作品要求：个人原创作品；内容围绕皮肤科病例的主旨，主题明确，内容健康。

三、投稿邮箱和截止时间：投稿邮箱pifujing@163.com，截止时间：2015年6月30日。

四、奖品设置：一等奖：1名，便携式皮肤镜一台（价值10 000元）；二等奖：2名，便携式皮肤镜一台（价值6 500元）；三等奖3名，皮肤放大镜一台（价值2 500元）。所有参赛人员均可获得纪念礼品，决赛于2015年7月中华医学会第二十一次皮肤性病学术年会期间举行，优秀作品可在年会展出。

详细投稿须知及赛程安排可登陆中华医学会皮肤性病学分会网站http://csd.cma.org.cn/查询。

北京协和医院皮肤科招收进修医师通知

北京协和医院皮肤科常年接受全国各省市三级以上医院皮肤科医师进修学习。条件如下：临床进修医师必须具备正规医学院校本科及以上学历（不包括续本），具备医师资格证书和医师执业证书以及从事3年以上临床工作;每年招收两期；报到时间为每年的3月和9月，进修期限为半年或一年。在北京协和医院官网-医学教育-进修国际合作页面下载相关表格。邮寄纸质版进修申请表（加盖医院公章）至北京市东城区帅府园1号，北京协和医院教育处，邮编100730，联系电话010-69156878；信息表发送至电子邮箱xiehejinxiu@163.com。

Effects of β-catenin on the proliferative activity of and expressions of two apoptosis-related genes Bcl-2 and Bax by human skin fibroblasts induced by hydrogen peroxide

Tian Liming,Xie Hongfu,Li Ji,Yang Ting*,Peng Yuan,Hu Wei.*Affiliated Nanhua Hospital,University of South China,Hengyang 421002,Hunan,China

ObjectiveTo investigate the effect of highly expressed β-catenin on the proliferative activity of and expressions of two apoptosis-related genes Bcl-2 and Bax by human skin fibroblasts induced by hydrogen peroxide（H2O2）.MethodsNormal human skin fibroblasts （HSFs）from child foreskin were divided into three groups:empty vector group transfected with the empty vector pcDNA3.1,H2O2group transfected with the empty vector pcDNA3.1 followed by treatment with H2O2（150 μmol/L）for 2 hours,β-catenin group transfected with pcDNA3.1-β-catenin followed by treatment with H2O2（150 μmol/L）for 2 hours.Subsequently,methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）assay was conducted to estimate proliferative activity of fibroblasts,flow cytometry to detect cell apoptosis,and reverse transcription （RT）-PCR and Western blot were performed to measure the mRNA and protein expressions of Bcl-2 and Bax respectively.The relative expression levels of genes were expressed as the ratios between the targets and GAPDH.ResultsSignificant differences were found between the empty vector group,H2O2group and β-catenin group in cellular proliferative activity（expressed as absorbance value at 570 nm:0.792±0.012 vs.0.462±0.012 vs.0.521±0.015,P＜0.01）and apoptosis rate（3.407%±0.217%vs.24.555% ±1.793%vs.15.360%±0.755%,P＜0.01）.Both mRNA and protein expression levels of Bcl-2 were significantly lower in the H2O2group（0.333±0.003 and 0.336±0.004 respectively）than in the empty vector group（0.507±0.013 and 0.514±0.021,respectively,bothP＜ 0.01）and β-catenin group（0.404±0.006 and 0.411±0.005,respectively,bothP＜0.01）.Increased expression levels of Bax mRNA and protein were observed in the H2O2group compared with the empty vector group and β-catenin group（mRNA:0.451±0.002 vs.0.303±0.005 and 0.339±0.012,protein:0.460±0.008 vs.0.320±0.013 and 0.346±0.013,allP ＜ 0.01）.ConclusionHigh expression of β-catenin can raise proliferative activity of aging HSFs.

Fibroblasts;Cell aging;β-catenin;Apoptosis;Genes,Bcl-2;Genes,Bax

Tian Liming，Email：jolly521@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.013

国家自然科学基金青年科学基金（81101212）；湖南省自然科学衡阳联合基金（10JJ9018）；湖北省自然科学基金（2012FFC083）；中国皮肤科医师协会-宝洁基金（2010CDA-P&G04）；中国皮肤科医师协会-复旦张江光动力基金（2012CDA-FDZJ01）；武汉市卫生局科学基金（WX12B20）；南华大学附属南华医院院内科研课题（10nyz01）

421002湖南衡阳，南华大学附属南华医院［田黎明（现在华中科技大学附属武汉市第一医院皮肤科，430022武汉）、杨婷、胡威］；中南大学湘雅医院皮肤科（谢红付、李吉）；湖北中医药大学基础医学院（彭圆）

田黎明，Email：jolly521@126.com

2014-06-05）

（本文编辑：吴晓初）