莴苣中两种致泻性大肠杆菌的富集及DNA提取方法的优化

董　妍，胡文忠，何煜波，姜爱丽，冯　可，白　雪（.大连工业大学食品学院，辽宁大连604；.大连民族学院生命科学学院，辽宁大连6600；.大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁大连604）

莴苣中两种致泻性大肠杆菌的富集及DNA提取方法的优化

董妍1，胡文忠2，*，何煜波2，姜爱丽2，冯可3，白雪2
（1.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034；2.大连民族学院生命科学学院，辽宁大连116600；3.大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁大连116024）

本研究对人工接种肠出血性大肠杆菌O157∶H7和肠侵袭性大肠杆菌的莴苣样品中菌体的富集和DNA提取方法进行了优化。研究中比较了不同过滤膜组合对菌体的富集效果，筛选了莴苣样品中细菌DNA提取的最适方法，建立了多重PCR方法检测人工污染莴苣样品。结果表明，采用尼龙膜15 μm+混合膜0.22 μm的组合富集细菌、试剂盒法提取样品中细菌DNA，多重PCR检测的检出限降低10倍，检测时间节省1.5 h。本研究可快速、简便、灵敏的应用于莴苣检测中，具有很高的实际应用价值。

鲜活农产品，致泻大肠杆菌，富集，DNA提取

近年来，致泻性大肠杆菌污染新鲜莴苣的事件常有发生，针对莴苣中致泻性大肠杆菌进行快速检测对保障食品安全是十分必要的。在目前的研究中，检测不同血清型的致泻性大肠杆菌常用传统方法费时、费力，越来越不能满足人们对食品安全的要求，而多重PCR技术因具有高效、灵敏、准确等特点，成为快速检测食源性致病菌方面的研究热点之一［1-2］。莴苣中所含致泻性大肠杆菌的数量往往较少，食品基质也会影响致病菌DNA的提取［3］，因此在进行多重PCR检测前对菌体的富集和DNA提取方法进行优化，能够有效降低对检测结果的干扰。翁思聪等［4］应用复合型増菌培养基使细菌共增长。郝玉芹等［5］应用FTA滤膜提取细菌DNA。白莉等［6］应用免疫磁珠富集肉制品中的致病菌，均为快速检测食品中致病菌提供了参考。在目前的研究中，针对肉类或乳类中致病菌的富集和DNA提取的研究较广泛，多重PCR技术也多应用于这两类食品的检测中，而莴苣等蔬菜中此类研究较少。因此，研究从莴苣中快速获得大量高质量的细菌DNA，以满足检测效率、检出限的要求，具有重要的实际意义［7-8］。

本研究通过将不同材质和孔径的过滤膜进行组合，对人工接种肠出血性大肠杆菌O157∶H7（Enterohemorrhagic E.coli，EHEC）和肠侵袭性大肠杆菌（Enteroinvasive E.coli，EIEC）的新鲜莴苣中两种致泻性大肠杆菌进行洗脱富集，结合不同种DNA提取方法的优化结果，应用于多重PCR检测中以提高检测效率和降低检出限，并对EHEC O157∶H7及EIEC的相关毒力基因以及两种菌共同的基因设计了三对特异性引物，以期为灵敏、准确、快速的检测新鲜莴苣中两种致泻性大肠杆菌提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 CICC 21530、肠侵袭性大肠杆菌CICC 10661、肠产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）CICC 10414、肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic E.coli，EPEC）CICC 10372、大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）CMCC 44102、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC 14028、乙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi B）CMCC 50094、三株单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19111、ATCC 19112、ATCC 19115、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538、副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）CICC 10435均由大连民族学院生命科学学院食品安全实验室提供；LB培养基青岛海博生物技术有限公司；多重PCR反应相关试剂及细菌DNA提取试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；Triton X-100等其他试剂国产分析纯试剂；过滤膜、砂芯过滤器国产实验材料；过滤膜材质及孔径见表1；新鲜莴苣购自大连开发区新玛特超市。

BioSpectrum 310凝胶成像系统美国UVP公司；Thermo Arktic PCR仪、酶标仪Thermo Fisher Scientific公司。

表1　过滤膜的材质和孔径Table 1　The material and pore size of filtration membranes

1.2实验方法

1.2.1引物的设计与合成针对EHEC O157∶H7的毒力基因O-antigen［9］、EIEC的毒力基因ipaH［10］和所有大肠杆菌共同的基因uidA［11］，根据GenBank中公布的相关序列，应用软件Primer Premier 5.0和Oligo 6.0设计3对特异性引物（表2），由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表2　多重PCR引物序列Table 2　Sequence specific primers of multiplex PCR

1.2.2样品处理及増菌培养将新鲜莴苣用无菌水洗净后在75%的酒精中浸泡10 min，取出待酒精挥发完全。每份样品称取25 g，加入到225 mL已添加了0.3 g/100 mL的甘露醇和1.0%的乳糖的LB营养肉汤培养基中，取浓度均为10 CFU/mL的EHEC O157∶H7和EIEC的菌悬液各1 mL，分别加入到各自的培养基中，37℃、180 r/min条件下振荡培养［7］。培养时间约为12 h，取出后均质，并设置空白对照实验。取适量均质液用无菌生理盐水按10倍梯度稀释至10-6倍进行菌落计数，其他的均质液备用。

1.2.3过滤膜组合的选择每次取约107CFU/mL的均质液50 mL，先将均质液通过大孔径膜，以截留样品均质后残留的固体等大体积物质，再取滤下的含菌体的培养液通过小孔径膜，使菌体脱离培养液而富集在膜表面上，通过菌落计数对不同材质和孔径的过滤膜进行优化。过滤膜的组合方式分别有以下几种：聚丙烯膜10 μm+混合膜0.22 μm、聚丙烯膜20 μm+混合膜0.22 μm、聚丙烯膜40 μm+混合膜0.22 μm、聚丙烯膜10 μm+混合膜0.45 μm、聚丙烯膜20 μm+混合膜0.45 μm、聚丙烯膜40 μm+混合膜0.45 μm、尼龙膜15 μm+混合膜0.22 μm、尼龙膜40 μm+混合膜0.22 μm、尼龙膜60 μm+混合膜0.22 μm、尼龙膜15 μm+混合膜0.45 μm、尼龙膜40 μm+混合膜0.45 μm、尼龙膜60 μm+混合膜0.45 μm。将富集后的小孔径过滤膜放入5 mL无菌生理盐水中，使用涡旋混合器2400 r/min振荡2 min，然后用玻璃棒刮擦表面1 min［12］，得到菌体的富集液。将不同过滤膜组合的富集液10倍梯度稀释后进行菌落计数，比较富集效果选出最佳过滤膜组合。

1.2.4基因组DNA的提取

1.2.4.1水煮法参照文献［13］并作改进：取1 mL均质液及其梯度稀释液分别离心12000 r/min离心2 min，弃上清，加入400 μL无菌水吹打混匀，12000 r/min离心1 min，弃上清，加入300 μL无菌水吹打混匀，煮沸10 min后迅速放在冰上10 min，12000 r/min离心5 min，取上清为模板。

1.2.4.2碱液加热裂解法参照文献［14］：取1 mL均质液及其梯度稀释液分别12000 r/min离心10 min，弃上清，加入20 mmol/L的NaOH溶液100 μL，混匀后煮沸10 min，迅速置于4℃中30 min，12000 r/min离心10 min，取上清为模板。

1.2.4.3Triton X-100直接裂解法参照文献［15］并作改进：取1 mL均质液及其梯度稀释液分别12000 r/min离心2 min，弃上清，加入100 μL 1%Triton X-100，吹打混匀，置于室温下10 min，5000 r/min离心1 min，取上清为模板。

1.2.4.4Triton X-100煮沸裂解法参照文献［15］并作改进：取1 mL均质液及其梯度稀释液分别加入到100 μL的1%Triton X-100中，涡旋振荡1 min混匀后煮沸10 min，迅速放在冰上10 min，5000 r/min离心1 min，取上清为模板。

1.2.4.5试剂盒法取1 mL均质液及其梯度稀释液分别按照宝生物工程（大连）有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书进行操作。

1.2.5DNA提取方法的选择先应用EHEC O157∶H7和EIEC纯菌菌株建立多重PCR反应，并验证引物特异性。然后对不同提取方法提取的基因组DNA分别进行多重PCR扩增，以比较应用于多重PCR反应中不同提取方法的检出限，综合DNA纯度来确定最佳DNA提取方法。同时取不同提取方法提取的模板DNA 2 μL，经酶标仪测定其在230、260、280 nm波长下的光吸收值，以超纯水为空白，每个样品重复三次，取三次结果的平均值，比较不同提取方法提取的DNA纯度。

对反应体系进行优化后，最终多重PCR反应体系确定为：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2 μL，DNA模板各1 μL，O-antigen基因引物（4 μmol/L）各1 μL，ipaH基因引物各1 μL，uidA基因引物各1.25 μL，rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，加RNase-Free Water至25 μL。对反应条件进行优化后，最终多重PCR反应条件确定为：94℃预变性4 min，94℃30 s、53℃30 s、72℃40 s，34个循环，72℃延伸7 min。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，95 V电泳1 h，在凝胶成像系统下观察结果。

1.2.6人工污染新鲜莴苣的检测应用最佳过滤膜组合对两种浓度均为7.8×107CFU/mL的致泻性大肠杆菌均质液及其10倍梯度稀释液分别进行洗脱富集，使得菌体浓度范围为7.8×107～7.8×101CFU/mL（以10倍为梯度）的样品分别经富集处理后得到各自的洗脱液，然后应用试剂盒法提取上述洗脱液中细菌DNA，所提取的DNA用于多重PCR方法，检测检出限并与未经富集样品的检出限对比，分析富集效果。

1.2.7实验数据处理与分析实验数据结果采用Excel2010软件进行统计分析。

2　结果与分析

2.1过滤膜组合的选择

先应用两种不同材质、五种孔径大小的大孔径过滤膜过滤含7.8×107CFU/mL致泻性大肠杆菌的样品均质液，再将含菌体的培养液分别通过两种不同孔径大小的小孔径过滤膜，通过菌落计数比较各种组合的富集效果（表3），结果显示尼龙材质的过滤膜的洗脱效果优于聚丙烯材质的过滤膜，孔径大小为15、40、60 μm的尼龙过滤膜洗脱细菌的能力大致相同，孔径大小为0.22 μm的过滤膜富集细菌的能力优于孔径大小为0.45 μm的过滤膜，考虑到大孔径过滤膜的孔径大小关系到其截留能力，过大的孔径不利于截留样品中残留的大体积固体，因此选择孔径大小为15 μm的尼龙过滤膜与孔径大小为0.22 μm的混合过滤膜组合对两种致泻性大肠杆菌进行洗脱富集。

表3　不同过滤膜组合对细菌的富集效果Table 3　The concentration effect of bacteria by different combinations of membrane filtration

2.2DNA提取方法的选择

2.2.1五种DNA提取方法所得DNA纯度比较对应用五种提取方法提取的基因组DNA经酶标仪测量其在230、260、280 nm波长下的光吸收值，计算出的OD260/OD230比值和OD260/OD280比值结果见表4。由表4结果可以看出用水煮法、Triton X-100直接裂解法、Triton X-100煮沸裂解法提取DNA的OD260/OD280比值均低于1.8，说明提取的DNA中可能含有较多的蛋白质、酚类等杂质；碱液加热裂解法和试剂盒法提取的DNA的OD260/OD280比值在1.8～2.0的范围内，说明提取的DNA中含较少的蛋白质、酚类等杂质，纯度较好。在五种提取方法中，只有用试剂盒法提取的DNA的OD260/OD230比值高于2.0，说明提取的DNA中去盐较充分，其他的四种方法去盐均不充分。因此，应用试剂盒法提取样品中致泻性大肠杆菌基因组DNA的纯度最好，其次为碱液加热裂解法，水煮法和Triton X-100煮沸裂解法提取DNA的纯度基本一致，Triton X-100直接裂解法提取DNA的纯度最差。

表4　不同提取方法提取细菌DNA纯度的比较Table 4　Comparison of different extraction method to extract the DNA purity of bacterias

图1　多重PCR反应的建立Fig.1　Establishment of multiplex PCR

2.2.2五种DNA提取方法所得DNA多重PCR检出限比较对两种致泻性大肠杆菌进行多重PCR反应建立的结果见图1，特异性验证结果见图2。在多重PCR反应中，由三条目的条带检测两种致泻性大肠杆菌，在反应中由O-antigen基因和uidA基因的引物共同鉴定EHEC O157∶H7，在178 bp和446 bp处出现两条特异性目的条带，由ipaH基因和uidA基因的引物共同鉴定EIEC，在303 bp和446 bp处出现两条特异性目的条带，将两种致泻大肠杆菌组合后对三种目的基因进行多重PCR反应，在178、303、446 bp处出现三条特异性目的条带，目的条带与预期大小符合，条带清晰且无非特异性扩增。

图2　多重PCR反应特异性验证结果Fig.2　The specificity of multiple PCR

应用五种DNA提取方法对含7.8×107CFU/mL致泻性大肠杆菌的样品均质液及其10倍梯度稀释液进行基因组DNA的提取，并分别进行多重PCR反应，各种提取方法的检出限检测结果见图3。水煮法提取DNA电泳检测的检出限为7.8×106CFU/mL，碱液加热裂解法提取DNA电泳检测的检出限为7.8×105CFU/mL，Triton X-100直接裂解法提取DNA电泳检测的检出限为7.8×106CFU/mL，Triton X-100煮沸裂解法提取DNA电泳检测的检出限为7.8×105CFU/mL，试剂盒法提取DNA电泳检测的检出限为7.8×104CFU/mL。由不同方法提取的基因组DNA，在多重PCR反应中均可以扩增出目的条带，目的条带与预期大小符合，其中应用试剂盒法提取样品中致泻性大肠杆菌基因组DNA的含量最多，其次为碱液加热裂解法和Triton X-100煮沸裂解法，含量最少的是水煮法和Triton X-100直接裂解法。综合五种不同的基因组DNA提取方法提取DNA的纯度及提取量，选择试剂盒法对人工接种新鲜莴苣中的EHEC O157∶H7和EIEC进行基因组DNA提取。

图3　不同DNA提取方法应用于多重PCR方法检出限的比较Fig.3　Comparison of the detection limit of multiplex PCR by different DNA extraction methods

2.3人工污染新鲜莴苣的检测

首先应用尼龙膜15 μm+混合膜0.22 μm的过滤膜组合，对含有7.8×107CFU/mL EHEC O157∶H7的样品均质液及其10倍梯度稀释液进行菌体的富集，再应用试剂盒法对各浓度梯度的富集液提取基因组DNA，同样方法处理含有7.8×107CFU/mL EIEC的样品均质液及其10倍梯度稀释液，用所提取的DNA进行多重PCR扩增，检出限结果见图4，结果显示含原始浓度为7.8×107～7.8×103CFU/mL的菌体样品均质液经尼龙15 μm+混合膜0.22 μm的过滤膜组合富集后用试剂盒法提取DNA，可在多重PCR反应中被检测出。应用优化后方法处理人工接种新鲜莴苣，多重PCR反应可检测出原始浓度最低为7.8×103CFU/mL的两种致泻性大肠杆菌。而未经菌体富集的人工接种新鲜莴苣样品检出限为7.8×104CFU/mL。用优化后方法组合处理人工接种新鲜莴苣的检出限降低了10倍，在接种量为10 CFU的条件下，检测时间比未经菌体富集的快1.5 h。

图4　应用优化后方法检测人工接种新鲜莴苣的检出限结果Fig.4　The detection limit of artificial lettuce infected with two pathogens by the optimized method

3　讨论

本研究应用多重PCR检测方法对人工接种EHEC O157∶H7和EIEC的新鲜莴苣进行了检测，本研究选取编码EHEC O157∶H7O抗原的O-antigen基因、编码EIEC侵袭性质粒抗原的ipaH基因和编码两种致泻性大肠杆菌产生β-葡萄糖醛酸酶的uidA基因为目的基因，设计三条特异性引物检测两种致泻性大肠杆菌，即每种菌由两条特异性引物共同鉴定，避免了假阳性的产生或与其他血清型的致泻性大肠杆菌产生交叉反应，保证了检测方法的准确性，结果显示所建立的多重PCR反应具有良好的特异性。吴家林等［16］设计了4对特异性引物应用多重PCR方法检测EHEC O157∶H7，避免了交叉反应。曲泽慧等［17］建立的检测产肠毒素大肠杆菌双重PCR检测方法，具有检出率高的优点。

本研究中采用大孔径过滤膜与小孔径富集膜组合的方法对人工接种EHEC O157∶H7和EIEC的新鲜莴苣中两种致泻性大肠杆菌进行洗脱富集，结合试剂盒法提取莴苣样品中的细菌DNA，能够有效降低莴苣样品中两种致泻性大肠杆菌的检出限，节省了检测时间，减少了培养基、食品基质等对多重PCR反应有抑制作用的物质，并且膜过滤方法还具有快速、经济的特点。胡朝友等［12］应用小孔径过滤膜富集饮用水中的大肠杆菌，应用于TaqMan探针实时荧光PCR检测中，检出限达到1 CFU/mL，低于本研究中的检出限，这可能是由于此文献与本研究的检测方法、样品种类、DNA提取方法、细菌模板DNA和引物之间抑制作用等因素不同，造成了灵敏度上的差异。本研究检测人工接种EHEC O157∶H7和EIEC的新鲜莴苣的检出限为7.8×103CFU/mL，此结果低于舒畅［3］和王慧等［18］应用多重PCR方法检测人工污染食品中多种致病菌的检出限，与贺晨［19］和王艳君等［20］的结果接近，这种灵敏度上的差异也可能是由于样品种类、细菌富集方法、DNA提取方法、多重PCR反应体系与条件等因素不同造成的［19］。

4　结论

本研究通过对人工接种新鲜莴苣中两种致泻性大肠杆菌的富集及DNA提取方法优化的研究发现，应用尼龙过滤膜15 μm+混合膜0.22 μm的过滤膜组合对菌体进行富集，采用试剂盒法提取基因组DNA，结合多重PCR方法检测人工接种EHEC O157∶H7和EIEC的新鲜莴苣，检出限为7.8×103CFU/mL，与未经菌体富集的样品相比，检出限降低了10倍，检测时间减少了1.5 h。此方法可快速、特异、灵敏的检测出两种致泻性大肠杆菌，可应用于新鲜莴苣中EHEC O157∶H7和EIEC的快速检测。

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Optimized methods for concentration and DNA extraction of two kinds of diarrheagenic Escherichia coli in fresh agricultural products

DONG Yan1，HU Wen-zhong2，*，HE Yu-bo2，JIANG Ai-li2，FENG Ke3，BAI Xue2
（1.College of Food Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China；2.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China；3.College of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116024，China）

To optimize the methods for concentration and DNA extraction of two pathogens in artificial lettuce infected with Enterohemorrhagic E.coli and Enteroinvasive E.coli.This study compared the concentration effect of different kinds of filtration membranes，and selected the best method of DNA extraction to extract the two athogens in lettuce sample.The multiplex PCR was used to detect the artificial lettuce infected with two pathogens.The results showed that the nylon membrane which had the pore size of 15 μm combined with mixed membrane which had the pore size of 0.22 μm was the best enrichment method.And the best DNA extraction method was slected by using the kit of bacterial genomic DNA extraction.The detection limit of lettuce samples by using multiplex PCR was decreased 10 times.The detection time was saved 1.5 h.The multiplex PCR combined with the optimized method was sensitive，fast and easy.This study had a high practical value.

fresh agricultural products；diarrheagenic Escherichia coli；bacteria concentration；DNA extraction

TS201.3

B

1002-0306（2015）20-0260-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.046

2015－02－02

董妍（1989-），女，在读硕士研究生，研究方向：食品安全，E-mail：dong_yan@126.com。

胡文忠（1959-），男，教授，研究方向：食品科学，E-mail：hwz@dlnu.edu.cn。

国家科技支撑计划项目（2012BAD38B05）；国家自然科学基金项目（31172009）；大连市科技计划项目（2012E13SF106）；大连市金州新区科技计划项目（2012-A1-049）。